背景糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD)是糖尿病主要的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏病(end stage renal disease,ESRD)的重要原因,这将造成沉重的家庭和社会负担。因此,积极探索DKD发生与发展的机制,制定有效的防治策略,是当前医学界所面临的重大挑战。足细胞是位于肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)外侧的一种终末分化脏层上皮细胞,在蛋白质滤过以及GBM成分更新等方面发挥举足轻重的作用。当足细胞受损时,足突出现广泛收缩、融合和减少,肾小球滤过屏障完整性遭到破坏并引发蛋白尿;而蛋白尿又进一步加重足细胞结构和功能异常,加速肾小球硬化。线粒体是维持细胞正常功能不可或缺的细胞器。而肾小球足细胞作为终末分化细胞,需要大量能量以维持其生物学功能。研究表明,线粒体功能障碍是DKD进展中的关键环节,是足细胞损伤的早期事件,但目前关于DKD足细胞线粒体功能障碍的具体机制尚未阐明。同时,越来越多的流行病学和临床前证据显示,DKD过程中趋化因子、粘附分子、促炎细胞因子及转录因子等相关炎症分子大量聚积,最终可导致肾小球硬化、肾小管萎缩和肾脏纤维化。值得注意的是,炎症反应与线粒体功能息息相关,线粒体不仅可以介导炎症反应,也可直接作用于炎症介质。然而,DKD期间足细胞线粒体损伤和炎症反应的具体机制仍不清楚,有待于深入研究予以揭示。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一组最小长度为200个核苷酸的转录本,且无法被翻译成蛋白质。现已知lncRNAs可以通过多种方式发挥生物学功能,包括顺式或反式调控转录、组织细胞核结构域以及直接调控蛋白质或RNA分子等。其中,长链非编码RNA浆细胞瘤变异易位1(plasmacytoma variant translocation 1,PVT1)位于人类染色体 8q24.21 区域。近年来多项研究发现,PVT1可通过降低肾脏滤过功能,导致肾脏疾病进展和肾功能衰竭;且PVT1与DKD显著相关,可增加DKD患者进展至ESRD的机率。上述研究提示,PVT1可能在DKD的发生发展中起重要作用,但具体机制有待进一步研究。因此,本研究以足细胞线粒体功能障碍和炎症反应为靶点,以临床病人生物样本、人足细胞系及足细胞特异性基因敲除小鼠为研究对象,观察PVT1及其靶向蛋白在DKD足细胞线粒体损伤和激活炎症反应中的核心作用,这将为阐明DKD发病机制提供新的视点。第一部分:PVT1参与DKD足细胞线粒体损伤及炎症反应目的:1、明确PVT1在DKD患者血浆及肾脏组织中的表达改变,以及PVT1表达量与DKD患者病程进展的相关性。2、明确PVT1在DKD小鼠肾脏组织中的表达改变。3、明确DKD小鼠发生足细胞线粒体功能紊乱及炎症反应。4、探讨调控PVT1对高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应的影响。方法:1、检测DKD患者生物样本中PVT1的表达以及炎症因子水平本研究共纳入47例DKD患者及25例健康成年人:①收集入组人群性别、年龄等基本资料及血糖、血脂、肾功能等生化指标;②收集入组人群的血浆及肾脏组织生物样本,real-time PCR检测血浆及肾脏组织中PVT1的表达丰度;③RNA 荧光原位杂交技术(RNA fluorescence in situ hybridization,RNA-FISH)联合免疫荧光技术检测PVT1在人肾脏肾小球中的定位及表达;④Spearman’s相关系数分析PVT1表达量与DKD患者的血肌酐(serum creatinine,Scr)和尿白蛋白肌酐比值(albumin/creatinine ratio,ACR)的相关性;⑤酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测 DKD 患者及健康对照组血浆中炎症因子的水平。2、构建DKD小鼠模型,检测小鼠肾脏组织中PVT1的表达随机将小鼠分为STZ组与CTL组,进行后续实验:①STZ组采用链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射法构建DKD小鼠模型,腹腔注射无菌柠檬酸缓冲液作为对照组(control,CTL);②DKDselleck HPLC模型构建成功后6W、8W、12W和20 W处死小鼠并取肾脏组织,real-time PCR检测小鼠肾脏组织中PVT1的表达丰度;②20 W时,RNA-FISH联合免疫荧光技术检测PVT1在小鼠肾小球中的定位及表达。3、检测DKD小鼠肾脏损伤DKD模型构建成功后20 W:①PAS及Masson染色观察肾小球病变情况;②透射电镜观察肾小球形态学改变。4、检测DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应DKD模型构建成功后20 W:①透射电镜观察肾小球足细胞线粒体形态学改变;②提取小鼠原代足细胞,线粒体耗氧率(O2consumptionrate,OCR)实验检测小鼠原代足细胞的线粒体功能;③real-time PCR检测小鼠肾脏组织中线粒体编码基因和氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)基因以及炎症因子水平。5、调控PVT1对高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应的影响培养人足细胞系:①足细胞特异性PVT1 ASO载体构建、转染及敲低效率鉴定后,将细胞分为低糖组(low glucose,LG)、高糖组(high glucose,HG)、HG+PVT1 ASO组以及HG+NC组;②RNA-FISH检测PVT1在上述四组足细胞中的定位及表达情况;②OCR实验检测上述四组足细胞的线粒体功能;③MitoSOX荧光染料检测上述四组足细胞线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)水平;④real-time PCR检测上述四组足细胞中炎症因子水平。结果:1、DKD患者生物样本中PVT1的表达以及炎症因子水平临床资料显示,DKD患者与对照组人群无年龄、性别差异,且两组在总胆固醇(total cholesterol)和低密度脂蛋白(LDL-c)方面无统计学差异。DKD患者的糖化血红蛋白(HbA1c)、ACR、Scr、尿素氮(BUN)以及甘油三酯(triglycerides)水平均高于对照组,eGFR水平则较对照组明显下降,差异具有统计学意义。与对照组相比,PVT1在DKD患者血浆及肾脏组织中的表达显著升高。且PVT1表达量与DKD患者Scr水平呈正相关(R=0.318,p=0.029),与患者ACR值亦呈正相关(R=0.535,p<0.01),差异具有统计学意义。此外,ELISA实验显示与对照组相比,DKD患者血浆中TNF-α的水平显著增加。2、PVT1在DKD患者及小鼠肾小球中的定位RNA-FISH联合免疫荧光显示,PVT1与肾小球足细胞特异性标志蛋白podocin存在共定位,提示PVT1主要在DKD患者及小鼠肾小球足细胞中表达,且在胞浆及胞核内均有分布。与对照组相比,DKD患者及小鼠肾小球足细胞蛋白podocin荧光强度明显下降,伴随PVT1荧光强度显著增加。3、PVT1在DKD小鼠肾脏组织中的表达动物实验中,real-time PCR实验显示DKD建模成功后6 W,CTL小鼠和STZ小鼠肾脏组织中PVT1的表达水平无显著差异,而随着病情进展,8 W后STZ小鼠肾脏组织中PVT1表达量显著增加。4、DKD小鼠发生肾脏损伤动物实验中,PAS染色显示DKD建模成功后20 W,与CTL组相比,STZ组肾小球区域明显存在基质扩张、系膜增生和动脉毛细血管狭窄。Masson染色显示STZ小鼠肾小球中存在明显的炎性细胞浸润和轻度胶原纤维化。透射电镜显示与CTL组相比,STZ小鼠足细胞足突发生广泛减少、收缩和融合,伴有明显的GBM增厚。5、DKD小鼠发生足细胞线粒体损伤及炎症反应动物实验中,透射电镜显示DKD建模成功后20 W,与CTL组相比,STZ组肾小球足细胞线粒体结构发生改变,表现为线粒体肿胀、碎裂及空泡化,线粒体嵴模糊甚至消失等。OCR实验显示与CTL小鼠相比,STZ小鼠原代足细胞的线粒体功能受损,表现为基础呼吸、最大呼吸以及备用呼吸能力均下降,ATP生成减少。Real-time PCR显示与CTL组相比,STZ小鼠肾皮质中线粒体编码基因和 OXPHOS 基因(mt-Col、mt-Rnr2、mt-Nd6、mt-Cytb、Cox4、Uqcrc2、Ndufb8和 Sdhb)以及线粒体转录因子 A(mitochondrialtranscriptionfactor A,Tfam)转录水平显著降低,STZ小鼠肾皮质中炎性细胞因子Il-6、Tnf-α和Cxcl10的表达明显增加。6、调控PVT1对高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应的影响细胞实验显示,PVT1在足细胞胞浆及胞核中均有分布,且与LG相比,HG组足细胞中PVT1表达量明显增加。OCR实验显示HG组足细胞线粒体功能受损,表现为基础呼吸、最大呼吸以及备用呼吸能力均下降,伴随ATP合成明显减少和mtROS产出增加。Real-time PCR显示高糖刺激下足细胞中Il-6、Tnf-α和Cxcl10的水平明显增加。转染PVT1 ASO载体特异性敲低其表达后,上述现象均得到明显逆转。结论:1、PVT1在DKD患者血浆及肾脏组织中的表达升高,其表达丰度与DKD患者病Biomass estimation程进展具有相关性。2、PVT1在DKD小鼠肾脏组织中表达升高。3、DKD小鼠疾病进展中伴随有足细胞线粒体功能紊乱及炎症反应的发生。4、抑制PVT1的表达可改善高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应。第二部分:PVT1调控TRIM56参与高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应的分子机制目的:1、探究高糖条件下PVT1表达量升高的分子机制。2、阐明足细胞发生线粒体损伤及炎症反应的核心环节。3、探究PVT1靶向下游蛋白TRIM56参与高糖环境下足细胞线粒体损伤及炎症反应的分子机制。4、阐明TRIM56调控AMPKα泛素化介导足细胞线粒体损伤及炎症反应的机制。5、探究TRIM56直接调控高糖环境下足细胞炎症反应的机制。方法:1、探究高糖条件下PVT1表达量升高的分子机制培养人足细胞系:①将细胞分为LG组和HG组,甲基化RNA免疫共沉淀(methylated RNAimmunoprecipitation,MeRIP)实验检测高糖刺激前后 PVT1 的m6A甲基化水平;②RNA-pull down实验联合Western blot实验检测与PVT1结合的蛋白;③足细胞特异性ALKBH5 siRNA(si-ALKBH5)和ALKBH5 over-expression(oe-ALKBH5)载体构建、转染及效率鉴定,real-time PCR 检测转染以上载体后足细胞PVT1表达量的改变;④将足细胞分为LG组、HG组、HG+PVT1 ASO组以及HG+NC组,使用α-鹅膏蕈碱抑制足细胞RNA生物合成,检测不同处理条件下PVT1的稳定性;⑤双荧光素酶报告基因实验检测PVT1的转录活性;⑥确定PVT1甲基化区域,构建野生型(wild type,WT)及甲基化位点突变型(mutanttype,MUT)PVT1荧光素酶报告基因质粒,进一步检测PVT1的m6A甲基化水平。2、探究高糖环境下足细胞发生线粒体损伤及炎症反应的核心环节培养人足细胞系,将细胞分为LG组、HG组、HG+PVT1 ASO组以及HG+NC组:①Western blot检测足细胞线粒体OXPHOS相关分子;②应用抗双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)抗体与抗Tom 20(线粒体外膜标志物)抗体进行免疫荧光共染,检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的定位及表达;③real-time PCR检测足细胞胞浆mtDNA水平;④Western blot检测足细胞cGAS-STING信号通路蛋白。3、探究PVT1靶向下游蛋白TRIM56介导足细胞线粒体损伤及炎症反应的分子机制培养人足细胞系:①RNA-pull down实验联合质谱分析以及Western blot实验检测与PVT1结合的蛋白;②将细胞分为LG组、HG组、HG+PVT1 ASO组以及HG+NC组,Western blot实验检测TRIM56表达量的改变;③足细胞特异性PVT1过表达载体(oe-PVT1)载体构建、转染及效率鉴定后,Western blot实验检测TRIM56表达量的改变;④将细胞分为LG组与oe-PVT1组,使用蛋白抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)处理足细胞,Western blot实验检测PVT1过表达后对TRIM56稳定性的影响;⑤截短实验探究PVT1与下游靶蛋白TRIM56的具体结合位点;⑥足细胞特异性TRIM56 siRNA(si-TRIM56)载体构建、转染及敲低效率鉴定后,将细胞分为LG组、HG组、HG+si-TRIM56组以及HG+NC组,OCR实验检测各组足细胞线粒体功能;⑦real-time PCR检测上述四组足细胞胞浆中mtDNA的表达量。4、探讨TRIM56调控足细胞线粒体损伤及炎症反应的分子机制培养人足细胞系:①查阅BioGRID、IntAct和STRING等数据库,寻找与TRIM56互作的蛋白;②免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验检测TRIM56与AMPKα的相互结合;③将细胞分为LG组、HG组、HG+PVT1 ASO组以及HG+NC 组,邻位连接技术(proximity ligation assay,PLA)检测 HG 及 PVT1 对TRIM56与AMPKα结合的影响;④足细胞转染si-TRIM56或过表达载体(oe-TRIM56)后,检测TRIM56对AMPKα的泛素化影响;⑤应用AMPKα抑制剂-compound C后,MitoTracker荧光染料检测线粒体形态学改变;⑥real-time PCR检测应用compound C后足细胞胞浆中mtDNA的水平;⑦Western blot实验检测应用compound C后足细胞线粒体OXPHOS相关分子以及cGAS-STING通路蛋白的表达情况;⑧使用AMPKα激动剂-AICAR后,将细胞分为LG组、HG组及HG+AICAR组,real-time PCR检测各组足细胞炎症因子水平。5、阐明TRIM56在高糖环境诱导足细胞炎症中的直接作用培养人足细胞系:①将细胞分为LG组和HG组,免疫荧光检测TRIM56与STING蛋白的定位及表达;②IP实验检测TRIM56与STING的相互作用以及TRIM56对STING蛋白泛素化的影响;③突变STING K150位点后检测STING蛋白泛素化水平和二聚体形成;④real-time PCR检测突变STING K150位点后高糖刺激对足细胞炎症因子IL-6水平的影响;⑤IP实验检测TRIM56对STING和下游效应分子TBK1结合的作用。结果:1、ALKBH5介导PVT1发生m6A去甲基化高糖条件下,足细胞PVT1与去甲基酶ALKBH5结合,在ALKBH5的作用下,PVT1发生m6A去甲基化且稳定性增加,而PVT1在转录水平未发生明显改变。高糖诱导PVT1高表达,使用si-ALKBH5载体转染足细胞后,PVT1表达量显著下降,oe-ALKBH5载体则可使PVT1表达量显著增加。此外,si-ALKBH5载体转染足细胞可明显降低PVT1野生型(WT)荧光素酶报告基因质粒的荧光强度,但不影响PVT1突变型(MUT)荧光素酶报告基因质粒的荧光强度。2、高糖刺激下足细胞线粒体受损释放mtDNA激活cGAS-STING通路Western blot实验显示与LG组相比,HG组足细胞中OXPHOS相关分子(CⅤ-ATP5A、CⅢ-UQCRC2、CⅣ-MTCO1、CⅡ-SDHB和CⅠ-NDUFB8)和TFAM分子蛋白水平显著降低,Bax水平显著升高。应用抗dsDNA抗体与抗Tom20抗体进行免疫荧光共染,结果显示高糖刺激下,足细胞线粒体外膜完整性遭到破坏,胞浆中dsDNA丰度显著升高,伴cGAS-STING通路(cGAS、STING、p-TBK1和p-p65)被激活。转染PVT1 ASO载体敲低其表达后,上述现象均得到明显逆转。3、PVT1与TRIM56相互结合RNA-pulldown实验证实PVT1与TRIM56蛋白存在相互结合关系。Western blot实验显示高糖条件下足细胞中TRIM56表达显著升高,特异性敲低PVT1后TRIM56表达下降,过表达PVT1后TRIM56表达增加。并且过表达PVT1可减缓TRIM56蛋白的降解速度,增加其稳定性。根据工具数据库预测分析,将PVT1基因分成三段截短序列分别进行富集蛋白分析,PVT1基因的649-1218 bp区域为结合TRIM56发挥功能的主要功能区段。4、抑制TRIM56对足细胞线粒体损伤及cGAS-STING通路的影响与LG组相比,HG组足细胞线粒体功能受损,表现为基础呼吸、最大呼吸以及备用呼吸能力降低,ATP生成减少,伴胞浆中mtDNA表达显著增加。同时,Western blot实验显示高糖条件下足细胞中cGAS-STING炎症通路被激活,通路相关蛋白cGAS、STING、p-TBK1和p-p65表达量明显增加。转染si-TRIM56载体特异性敲低其表达后,上述现象均得到明显逆转。5、TRIM56调控AMPKα泛素化修饰IP和PLA实验证实足细胞中TRIM56与AMPKα相互结合,与LG组相比,高糖刺激显著增强了 TRIM56与AMPKα的内源性结合,并且使用PVT1 ASO后,二者的结合水平明显下降。与LG组相比,高糖刺激下足细胞AMPKα发生泛素化修饰,过表达TRIM56后,AMPKα的泛素化水平显著增加。6、抑制AMPKα对足细胞线粒体结构和功能的作用Western blot实验显示应用AMPKα抑制剂compound C后,足细胞线粒体OXPHOS 相关分子(CⅤ-ATP5A、CⅢ-UQCRC2、CⅣ-MTCO1、CⅡ-SDHB和CⅠ-NDUFB8)、TFAM及PGC-1α蛋白水平显著降低,Bax和Drpl表达显著增加。MitoTracker染色显示高糖条件下线粒体分裂增加、融合减少,伴胞浆mtDNA的水平显著增加。7、抑制AMPKα对足细胞cGAS-STING通路及炎症反应的影响Westernblot 实验显示应用 AMPKα 抑制剂 compound C 后,cGAS-STING 炎症通路(cGAS、STING、p-TBK1 及 p-p65)被激活。Real-time PCR 显示与 HG组相比,AMPKα激动剂AICAR的使用可明显降低足细胞炎性细胞因子11-6、Tnf-α和Cxcl10的水平。8、TRIM56调控STING的泛素化直接参与足细胞炎症反应免疫荧光共染显示足细胞中TRIM56与STING相互结合,与LG组相比,高糖刺激显著增强了 TRIM56与STING的内源性结合。且高糖条件下STING K150位点的泛素化修饰介导STING二聚体形成,最终影响炎症因子IL-6的释放。同时,TRIM56的存在强化了 STING与下游效应分子TBK1的结合,并导致STING发生磷酸化。结论:1、高糖条件下,ALKBH5介导的PVT1 m6A去甲基化稳定PVT1的表达。2、高糖导致的足细胞线粒体损伤释放mtDNA进入胞浆激活cGAS-STING信号通路是引发炎症反应的核心环节。3、高糖条件下,PVT1通过抑制TRIM56蛋白降解进而增强AMPKα的泛素化修饰,导致足细胞线粒体生物合成及分裂融合异常,引发炎症反应。4、TRIM56通过调控STING的泛素化修饰直接参与足细胞炎症反应。第三部分:足细胞靶向抑制PVT1改善DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应目的:1、探究足细胞靶向抑制PVT1对小鼠生长发育的影响。2、阐明足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠肾脏损伤的影响。3、明确足细胞靶向抑制PVT1可以减轻DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应。方法:1、构建足细胞靶向抑制PVT1小鼠构建足细胞靶向抑制 PVT1 小鼠(Nphsep2-Cr+/Pvt1+/+,Nhs2-Cre+/Pvt1fox/fox),RNA-FISH联合免疫荧光技术检测PVT1在小鼠肾小球中的敲除效率。2、DKD小鼠模型构建采用STZ注射法进一步构建DKD小鼠疾病模型(STZ-Cre+/Pvt1+/+,STZ-Cre+/Pvt1flox/flox),或腹腔注射无菌柠檬酸缓冲液作为对照组(CTL-Cre+/Pvt1+/+,CTL-Cre+/Pvt1fox/flox),造模成功后4 W至20 W检测小鼠体重、血压、血糖、ACR等指标。3、足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠肾脏损伤的影响DKD小鼠模型构建成功后20 W处死小鼠并取肾脏组织:①PAS及Masson染色观察肾小球病变情况;②组织免疫荧光检测足细胞标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达;③透射电镜观察小鼠肾小球足细胞形态学改变。4、足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应的作用DKD小鼠模型构建成功后20 W处死小鼠并取肾脏组织:①提取并培养小鼠原代足细胞,OCR实验检测小鼠原代足细胞的线粒体功能;②Western blot实验检测小鼠原代足细胞中线粒体OXPHOS相关分子;③real-time PCR检测小鼠原代足细胞胞浆中mtDNA的表达量;④real-time PCR检测小鼠肾皮质中炎症因子水平。结果:1、足细胞靶向抑制PVT1对小鼠生长发育的影响各观察时间段内,CTL-Cre+/Pvt1+/+组及CTL-Cre+/Pvt1flox/flox组体重无显著差别,自6 W起STZ-Cre+/Pvt1+/+组分别较CTL-Cre+/Pvt1+/+组显著下降,且4 W、6W、8W 及 12W 时 STZ-Cre+/Pvt1flox/flox组较 STZ-Cre+/Pvt1+/+组体重有所上升,但无统计学差异,20W时STZ-Cre+/Pvt1flox/flox组较STZ-Cre+/Pvt1+/+组体重显著上升。各观察时间段内,CTL-Cre+/Pvt1+/+组及CTL-Cre+/Pvt1flox/flox组小鼠血糖无显著差别,STZ-Cre+/Pvt1+/+组分别较CTL-Cre+/Pvt1+/+组显著增加,STZ-Cre+/Pvt1flox/flox组较STZ-Cre+/Pvt1+/+外组血糖无显著差别。各观察时间段内,CTL-Cre+/Pvt1+/+组及CTL-Cre+/Pvt1flox/flox组小鼠ACR无显著差别,自8 W后STZ-Cre+/Pvt1+/+组分别较CTL-Cre+/Pvt1+/+组显著增加,且自8W后STZ-Cre+/Pvt1flox/fox组较STZ-Cre+/Pvt1+/+组ACR 水平明显下降。各观察时间段内,四组小鼠血压水平无显著差异。2、足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠肾脏损伤的影响DKD小鼠建模成功后20 W,PAS和Masson染色提示与CTL-Cre+/Pvt1+/+组相比,STZ-Cre+/Pvt1+/+组肾小球区域存在基质扩张、系膜增生、炎性细胞浸润和胶原纤维化的现象,而STZ-Cre+/Pvt1flox/flox组较STZ-Cre+/Pvt1+/+组肾小球损伤明显改善。组织免疫荧光显示PVT1敲除后,足细胞特异性标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达回升。透射电镜显示与CTL-Cre+/Pvt1+/+组相比,STZ-Cre+/Pvt1+/+组肾小球足细胞足突广泛融合,GBM明显增厚,PVT1敲除后肾小球形态损伤减轻。3、足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠线粒体损伤作用DKD小鼠建模成功后20 W,OCR实验显示与CTL-Cre+/Pvt1+/+组相比,STZ-Cre+/Pvt1+/+小鼠原代足细胞的线粒体功能受损,足细胞靶向抑制PVT1可明显改善线粒体最大呼吸和ATP生成,但基础呼吸和备用呼吸能力未有明显变化。Western blot 实验显示 STZ-Cre+/Pvt1flox/flox 组较 STZ-Cre+/Pvt1+/+组小鼠原代足细胞 OXPHOS 相关分子(CⅤ-ATP5A、CⅢ-UQCRC2、CⅣ-MTCO1、CⅡ-SDHB和CⅠ-NDUFB8)和TFAM分子蛋白水平显著增加,Bax和Drp1表达下降,并伴随足细胞胞浆中mtDNA含量下降。4、足细胞靶向抑制PVT1对DKD小鼠炎症反应的影响DKD 小鼠建模成功后 20 W,real-time PCR 显示 STZ-Cre+/Pvt1flox/flox组较STZ-Cre+/Pvt1+/+组小鼠肾皮质中炎性细胞因子11-6、Tnf-α和Cxcl10的表达显著降低。结论:1、足细胞特异性PVT1敲除小鼠构建成功。2、足细胞靶向抑制PVT1改善DKD小鼠体重下降并降低DKD小鼠蛋白尿水平。3、足细胞靶向抑制PVT1缓解DKD小鼠肾小球损伤。4、足细胞靶向抑制PVT1减轻DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应。第四部分:足细胞靶向抑制TRIM56改善DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应目的:1、探究足细胞靶向抑制TRIM56对小鼠生长发育的影响。2、阐明足细胞靶向抑制TRIM56对DKD小鼠肾脏损伤的影响。3、明确足细胞靶向抑制TRIM56可以减轻DKD小鼠线粒体损伤及炎症反应。4、明确TRIM56靶向AMPKα介导DKD小鼠肾脏损伤和炎症反应。方法:1、构建足细胞靶向抑制TRIM5小鼠构建足细胞靶向抑制TRIM56小鼠(Nphs2-Cre+/Trim56+/+,Nphs2-Cre+/Trim56flox/flox),免疫荧光技术和Western blot实验检测TRIM56在小鼠肾小球中的敲除效率。2、DKD小鼠模型构建采用STZ注射法进一步构建DKD小鼠疾病模型(STZ-Cre+/Trim56+/+,STZ-Cre+/Trim56flox/flox),或腹腔注射无菌柠檬酸缓冲液作为对照组(CTL-Cre+/Trim56+/+,CTL-Cre+/Trim56flox/flox),造模成功后4W 至 20 W 检测小鼠体重、血压、血糖、ACR等指标。3、探究足细胞靶向抑制TRIM5对DKD小鼠肾脏损伤的影响DKD小鼠建模成功后20 W处死小鼠并取肾脏组织:①PAS及Masson染色观察肾小球病变情况;②组织免疫荧光检测足细胞损伤标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达;③透射电镜观察小鼠的肾小球足细胞形态学改变。4、探究足细胞靶向抑制TRIM5对DKD小鼠线粒体结构和功能的影响DKD小鼠建模成功后20W处死小鼠,提取并培养小鼠原代足细胞:①透射电镜观察原代足细胞线粒体形态学改变;②OCR实验检测小鼠原代足细胞的线粒体功能。5、明确TRIM56靶向AMPKα介导DKD小鼠肾脏损伤和炎症反应对Nphs2-Cre+/Trim56+/+和Nphs2-Cre+/Trim56flox/fox小鼠腹腔注射STZ构建DKD模型,造模成功后6W进行AICAR腹腔注射,剂量为每天0.5mg/g,持续14 W,对照组小鼠则腹腔注射PBS缓冲液。将小鼠分为STZ-Cre+/Trim56+/++AICAR 组、STZ-Cre+/Trim56+/++PBS 组、STZ-Cre+/Trim56flox/flox+AICAR 组以及 STZ-Cre+/Trim56flox/flox+PBS 组。AICAR 持续注射 14 W 后,将小鼠处死并取肾脏组织:①PAS及Masson染色观察肾小球病变情况;②组织免疫荧光检测足细胞损伤标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达;③Wstern blot实验检测小鼠原代足细胞中cGAS-STING通路蛋白的表达。结果:1、足细胞靶向抑制TRIM56对小鼠生长发育的影响各观察时间段内,CTL-Cre+/Trim56+/+组及CTL-Cre+/Trim56flox/flox组体重无显著差别,自6 W后STZ-Cre+/Trim56+/+组分别较CTL-Cre+/Trim56+/+组显著下降,且自 6 W 后 STZ-Cre+/Trim56flox/flox组均较 STZ-Cre+/Trim56+/+组体重明显上升。各观察时间段内,CTL-Cre+/Trim56+/+组及 CTL-Cre+/Trim56flox/flox组小鼠血糖无显著差别,STZ-Cre+/Trim56+/+组分别较CTL-Cre+/Trim56+/+组显著增加,STZ-Cre+/Trim56flox/flox组较STZ-Cre+/Trim56+/+组血糖无显著差别。各观察时间段内,CTL-Cre+/Trim56+/+组及 CTL-Cre+/Tm56flox/flox组ACR 无显著差别,STZ-Cre+/Trim56+/+组分别较CTL-Cre+/Trim56+/+组显著增加,且自8W后STZ-Cre+/Trim56flox/flox组较 STZ-Cre+/Trim56+/+组 ACR 水平明显下降。2、足细胞靶向抑制TRIM56对DKD小鼠肾脏损伤的影响DKD小鼠建模成功后20W,PAS和Masson染色显示与CTL-Cre+/Trim56+/+组相比,STZ-Cre+/Trim56+/+组肾小球区域存在基质扩张、系膜增生、炎性细胞浸润和胶原纤维化的现象,而STZ-Cre+/Trim56flox/flox组较STZ-Cre+/Trim56+/+组肾小球损伤明显改善。组织免疫荧光显示TRIM56敲除后,足细胞特异性标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达回升。透射电镜显示与CTL-Cre+/Trim56+/+组相比,STZ-Cre+/Trim56+/+组肾小球足细胞足突广泛融合,GBM明显增厚,而足细胞靶向抑制TRIM56可明显减轻肾小球足突融合。3、足细胞靶向抑制TRIM56对DKD小鼠线粒体结构和功能的作用DKD小鼠建模成功后20 W,透射电镜显示与CTL-Cre+/Trim56+/+组相比,STZ-Cre+/Trim56+/+组原代足细胞线粒体发生肿胀、碎裂和空泡化,线粒体嵴模糊甚至消失,足细胞靶向抑制TRIM56后线粒体形态破坏得到显著改善。OCR实验显示与CTL-Cre+/Trim56+/+组相比,STZ-Cre+/Trim56+/+小鼠原代足细胞的线粒体功能受损,足细胞靶向抑制TRIM56可明显改善线粒体功能,表现为基础呼吸和最大呼吸升高,ATP合成增加,但备用呼吸能力并无明显改变。4、TRIM56靶向AMPKα介导DKD小鼠肾脏损伤PAS 和 Masson 染色显示,STZ-Cre+/Trim56flox/flox与STZ-Cre+/Trim56+/+组小鼠注射AICAR后,肾小球损伤程度均较PBS组有明显改善,伴随足细胞特异性标志蛋白synaptopodin和WT-1的表达回升。5、TRIM56靶向AMPKα对DKD小鼠炎症反应的影响Western blot实验显示与PBS对照组相比,STZ-Cre+/Trim56+/+组与STZ-Cre+/Trim56flox/flox小鼠注射 AICAR 后,cGAS-STING 信号通路蛋白 cGAS、STING、p-TBK1及p-p65表达明显下降。结论:1、足细胞特异性TRIM56敲除小鼠构建成功。2、足细胞靶向抑制TRIM56改善DKD小鼠体重下降并降低DKD小鼠蛋白尿水平。3、足细胞靶向抑制TRIM56缓解DKD小鼠肾小SCH727965小鼠球损伤。4、足细胞靶向抑制TRIM56通过AMPKα介导DKD小鼠线粒体损伤和炎症反应。