视网膜血管生成(Angiogenesis)是从已有的毛细血管通过血管内皮细胞的出芽、增殖、迁移、修剪及成熟等复杂的步骤形成新生血管的过程,受到细胞内外多种信号精细调控,其中任何一环节出现异常,都可能导致视网膜血管异常性眼病。家族性渗出性玻璃体视网膜病变(familial exudative vitreoretinopathy,FEVR)是其中一种遗传性致盲眼病,其主要特征是视网膜周边血管发育不完全,视力进行性下降,甚至失明,患病率可达4.6‰。疾病早期可使用激光光凝治疗渗漏,而疾病晚期缺乏有效的治疗方法。FEVR具有临床和遗传异质性,目前已报道的FEVR相关基因突变仅能解释约50%临床病例,因此确定新的致病相关基因并挖掘已知基因的新突变对于该病的分子诊断至关重要。Wnt信号通路是调控多种组织以及器官发育的重要通路之一,在selleckchem维持组织稳态、促进血管生成、调控炎症免疫反应及损伤修复等生理与病理过程中都发挥重要作用,该通路在视网膜血管生成及发育中也至关重要。本研究利用全外显子测序,筛选FEVR的致病候选基因及突变,并通过构建小鼠模型及体内外功能研究探究候选基因的致病机制,完善FEVR的致病基因突变谱,从而为深入探究该病的诊疗提供方向。本论文的主要研究内容如下:1.收取FEVR家系基因组DNA,利用全外显子测序技术及生物信息学分析筛选FEVR的候选致病基因及突变,通过SBiomimetic scaffoldanger测序验证并结合临床资料分析,考察相关基因突变位点的物种保守性,并进行突变的致病性预测。我们筛查到FEVR的致病基因P120基因及其3个突变、EMC1基因及其1个突变以及已知FEVR致病基因LRP5的4个突变、TSAPN12的6个突变、NDP的3个突变。2.P120基因在视网膜血管生成中的研究。本研究构建P120血管内皮特异性敲除小鼠模型,研究表明P120敲除后,小鼠视网膜出现血管生长迟缓、周围血管密度增大、内部血管密度降低、渗漏、动静脉交叉等FEVR样表型。利用体内外实验结合蛋白组学及挽救实验,发现P120缺失导致cadherin/catenin复合物的破坏和Wnt信号通路的抑制。并构建了P120i ECKO/+Ctnnb1i ECKO/+和P120i ECKO/+Ctnna1i ECKO/+双杂小鼠模型,发现P120和Ctnnb1、Ctnna1可能存在遗传学上的相互作用,进一步证明P120缺失引起的血管生成缺陷可能主要是由于Wnt信号受损,重复了Wnt相关FEVR小鼠模型(FVX-765zd4-/-,Lrp5-/-,Tspan12-/-,Ndp-/-,Ctnnb1i ECKO/i ECKO)典型表型。此外,还发现P120敲除可造成视网膜血管内皮细胞间的连接破坏并导致严重的渗漏及免疫反应,影响血管生长,这与传统Wnt相关的FEVR小鼠模型(Fzd4-/-,Lrp5-/-,Tspan12-/-,Ndp-/-,Ctnnb1i ECKO/i ECKO)有所不同。论文进而对FEVR家系中筛选的3个突变(Arg317Cys、Lys623Ter、Arg700Gln)进行体外功能验证,证实突变通过破坏cadherin/catenin复合物和抑制Wnt信号通路导致FEVR。本论文揭示P120通过破坏cadherin/catenin复合物和抑制Wnt信号通路导致FEVR的致病机制,为FEVR的治疗提供新靶点。3.EMC1在视网膜血管生成中的机制研究。本研究构建Emc1血管内皮特异性敲除小鼠模型,发现该小鼠出现典型的视网膜血管生长发育迟缓、渗漏的FEVR小鼠模型的表型,揭示了Emc1在小鼠视网膜血管发育中的重要作用。利用体内外实验结合转录组学分析及挽救实验,发现EMC1缺失通过影响FZD4受体的表达,异常调控Wnt/β-catenin信号通路,使血管内皮细胞增殖减缓,最终导致FEVR的发生。此外,本论文在FEVR家系中鉴定了1个EMC1的突变Ile762Val,该突变可导致Wnt/β-catenin通路活性降低。本研究揭示了EMC1通过影响FZD4蛋白表达而调控Wnt信号通路参与视网膜血管发育,其异常或可导致FEVR的发生。4.对LRP5基因的4个突变:c.1801G>T(p.Gly601Ter)、c.1965del C(p.His656Thrfs Ter41)、c.4445del C(p.Ser1482Cysfs Ter17)和c.4482del C(p.Pro1495Argfs Ter4)),TSAPN12基因的6个突变:(c.193C>G(p.Pro65Ala)、c.242G>C(p.Gly81Ala)、c.251G>A(p.Gly84Glu)、c.375G>A(p.Trp125Ter)、c.575_576del AG(p.Gln192Argfs Ter8)、c.689T>C(p.Ile230Thr),以及NDP基因的3个突变:c.124C>A(p.His42Asn)、c.329G>A(p.Cys110Tyr)、c.334_349del(p.Gly112Leufs Ter145)进行体外实验功能分析探究其致病机制。双荧光素酶报告基因实验表明该13个突变均导致Norrin/β-catenin信号通路活性下降。蛋白免疫印迹实验发现移码突变及无义突变可导致其基因编码蛋白的表达水平降低,所有突变均可造成Wnt通路相关靶基因下调。利用结构及功能分析,发现TSPAN12的4个错义突变造成TSPAN12蛋白膜定位受损;NDP的突变破坏了Norrin和FZD4或LRP5相互作用,利用过表达的TSPAN12蛋白可在一定程度上挽救NDP突变所造成的蛋白相互作用的破坏及Norrin/β-catenin信号通路活性的降低,为FEVR的治疗提供新方向。综上,本研究阐明了P120基因、EMC1基因在视网膜血管生成发育中的重要功能,同时探讨了LRP5、TSPAN12、NDP突变的致病机制,拓宽了家族性渗出性玻璃体视网膜病变致病基因和突变谱,为其诊疗提供了新的理论依据。