里氏木霉(Trichoderma reesei)是当前纤维素酶生产的主要工业丝状真菌,也是研究纤维素酶表达分泌的模式菌株。该菌是二战时从腐www.selleck.cn/products/vx-661烂的军用帆布中分离获得,起始菌株命名为QM6a,经过多轮诱变获得了产酶水平显著提高的系列突变株,其中,RUT-C30是目前广泛应用的高产纤维素酶工业菌株,纤维素酶产量比QM6a高15-20倍。尽管目前对里氏木霉的研究大多集中于纤维素酶的产酶机制,由于纤维素降解酶系比较复杂、合成分泌与细胞全局调控紧密相关,尤其是基因组中许多未知功能基因未被鉴定,产酶机制解析依然存在大量盲点。另外,里氏木霉分泌的纤维素降解酶系虽然包含大量纤维素酶,但对于降解不同木质纤维素底物来说酶系仍然不平衡。特别是,纤维素酶生产成本高依然阻碍着纤维素类生物质资源转化。因此,进一步提升菌株纤维素酶生产能力并深入研究酶系组成和新基因功能,将有助于阐释产酶机制并构建酶系优化的工程菌株,从而提高纤维素生物质的转化效率、降低纤维素酶生产成本,促进实现生物质资源转化的经济可行性。本实验室前期在里氏木霉RUT-C30基础上通过深度诱变获得了纤维素酶产量比RUT-C30高3-4倍的超高产突变株CU7-4。本论文以CU7-4菌株为研究对象,利用组学技术、遗传学策略等深入解析该菌株的分泌酶系、高产机制及碳代谢物阻遏(CCR)产酶规律,并进一步构建酶系优化的工程菌株。主要研究内容如下:1.突变株CU7-4胞外酶系高效降解木质纤维素机制解析将CU7-4和RUT-C30的胞外纤维素酶系用于糖化酸处理的玉米芯底物(ACR)和脱木素的玉米芯底物(DCR)发现,CU7-4比RUT-C30糖化效率均提高20%～21%,说明CU7-4胞外酶系具有更高效的降解木质纤维素能力。然后利用比较蛋白组学策略分析了 CU7-4与RUT-C30胞外酶系差异,发现纤维素酶系组分比例发生了较大变化,如内切葡聚糖酶显著提高等。进一步分析分泌量差异大且响应于转录激活因子Xyr1的蛋白,筛选出五个潜在靶点:三个富含半胱氨酸的小分子分泌蛋白SSP1、EPL1和CUT1以及两个β-葡萄糖苷酶Ce13H和Ce13F。通过基因敲除研究发现,两个小分子分泌蛋白SSP1和EPL1的敲除导致降解不同木质纤维素底物能力提升,尤其是降解低木质素含量底物ACR、DCR和NPCS(碱预处理玉米秸秆)的效果更为显著。其中SSP1敲除后的胞外酶系糖化NPCS效率比出发菌株提高了 37.1%。这表明SSP1和EPL1在里氏木霉水解木质纤维素的过程中发挥了重要作用。对Ce13H和Ce13F进行基因敲除与过表达研究发现,Ce13F的过表达可引起纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶活力提升,说明Cel3F在里氏木霉产酶过程中可能发挥重要作用。进一步将单一的Ce13F蛋白添加至里氏木霉酶液中研究其对糖化玉米芯底物的作用,结果表明,添加10%蛋白量的Ce13F引起的糖化效率增加量相当于添加超过50%蛋白量RUT-C30酶液的效果,这表明Cel3F可以显著提升里氏木霉纤维素酶系降解木质纤维素的效率。2.突变株CU7-4高产纤维素酶的分子机制解析首先使用转录组测序对CU7-4与RUT-C30进行差异比较,发现显著变化的基因大多富集于胞外蛋白基因,特别是与降解木质纤维素有关的碳水化合物水解酶(Cazymes),其中β-葡萄糖苷酶类基因富集程度极高,说明它们在高产纤维素酶过程中可能发挥了重要作用。进一步分析KEGG通路中的差异基因分布情况,发现转录因子TFIIH的三个亚基TTDA、TFIIH2和MANT1的编码基因转录水平显著上调。分别对其编码基因ttda、tf2h2和mant1进行不同程度表达,发现它们的低表达均对纤维素酶基因转录产生影响,尤其是TTDA的低表达显著降低了纤维素酶的基因转录和分泌水平,而三个基因的增强表达均未对纤维素酶表达产生显著影响。由于TFIIMining remediationH既是基础转录因子,同时也是参与核酸切除修复(NER)的保守蛋白,因此推测,可能紫外诱变刺激了 CU7-4的NER途径导致三个亚基表达提高,但对纤维素酶表达未产生直接影响。然后通过基因组重测序分析了 CU7-4的突变情况,共检测到单核苷酸多态性(SNP)突变59个以及小片段插入/缺失(InDel)21个(全部位于基因间区)。对导致非同义突变的12个SNP进行了所在基因的单基因敲除研究,发现其中一个基因tre130442(编码染色质重塑复合物INO80亚基)的敲除严重阻碍了里氏木霉生长并显著降低了纤维素酶生产。进一步的转录水平分析表明该基因对纤维素酶的影响并非由菌丝生长缺陷导致;而单独构建的该基因单核苷酸突变对菌株生长产生一定负面影响。结合转录组数据分析,推测该基因对CU7-4生长的影响可能是综合了 SNP、表达量降低及参与DNA修复等因素的结果。另外,基因组测序还发现CU7-4中存在三个大片段结构性变异,包括两个倒位片段和一个重复片段,涉及400个基因,其中的糖苷水解酶、转录因子及转运蛋白等编码基因的转录水平差异显著,它们可能在纤维素酶高产中也起到了潜在重要作用。3.CU7-4菌株脱碳代谢物阻遏的研究在不同碳源中培养CU7-4并检测其产酶能力发现,葡萄糖条件下selleckchem PF-02341066纤维素酶活与RUT-C30在纤维素条件下酶活相当,而纤维二糖条件下其纤维素酶活是RUT-C30的8.3倍;并且CU7-4在纤维素碳源中添加葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖时依然能产生与单一纤维素条件下相当的纤维素酶,而此时RUT-C30几乎无纤维素酶产生,这些结果说明CU7-4的碳代谢物阻遏途径(CCR)可能进一步受损,也就是比RUT-C30具有了更高程度的脱CCR能力。同时,CU7-4相比RUT-C30的葡萄糖消耗能力有所下降,尤其是进一步分析CU7-4中CCR途径相关基因在葡萄糖中的转录水平发现,葡萄糖转运蛋白Glt1和调节其表达的转录因子BglR以及主导CCR的转录抑制因子Cre1的基因表达水平显著下调。此外,产酶过程中添加不同浓度葡萄糖的研究发现,CU7-4对葡萄糖抑制的抵抗能力增强,且在添加10 mM葡萄糖时纤维素酶产量最高(达到8.75 IU/mL),比纯纤维素条件下提升19%。这些结果表明,CU7-4的脱CCR程度更高,且在葡萄糖存在时能够高产纤维素酶。4.以内切葡聚糖酶和β葡萄糖苷酶为靶点构建酶系优化工程菌内切葡聚糖酶与β-葡萄糖苷酶既是CU7-4中显著高表达的酶组分也是高效降解纤维素酶系的关键组分,因此本研究以此为靶点蛋白进行酶系优化的菌种改良。首先构建了融合强诱导型启动子Pcbh1调控区与强组成型启动子Pcdna1核心区的新型强杂合启动子Pcc。该启动子具备纤维素诱导条件或葡萄糖条件下均可强驱动基因表达的能力,尤其是在纤维素条件下的表达强度分别是Pcbh1和Pcdna1的1.6和1.8倍。然后,使用Pcc分别过表达内切葡聚糖酶基因eg2和β-葡萄糖苷酶基因bglA,使得内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的酶活均显著提升,并分别提升了总纤维素酶酶活150%和85%。进一步使用Pcc将两基因同时过表达,实现了总纤维素酶活提高178%,且其酶系对ACR和DCR的降解能力均提高了 130%～140%,从而构建了酶系优化的里氏木霉工程菌株,为降低产酶成本提供了菌株资源,也有助于经济可行的木质纤维素资源转化。