目的:前期研究发现天然植物化学物葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins extract,GSPE)对DN大鼠具有保护作用,但具体机制尚不清楚。本研究旨在DN背景下从铁死亡角度探讨GSPE对DN大鼠肾组织和HK2(human kidney-2,HK2)细胞损伤的影响及作用机制。方法:动物实验:45只SPF级SD大鼠,随机选取10只作为对照组,剩余35只大鼠使用高糖高脂饲料喂养并联合链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型。以大鼠随机血糖>16.7 mmol/L作为2型糖尿病模型成功标准,符合血糖标准的大鼠继续高糖高脂喂养12周,检测大鼠24 h尿白蛋白>30 mg/d即确定糖尿病肾病模型复制成功。将造模成功的31只大鼠随机分为DN模型组、GSPE(250 mg/kg)组和Ferrostatin-1(2.5μmol/kg)组,Fer-1、GSPE持续干预大鼠12周。全自动生化分析仪检测各组大鼠血尿素氮、血肌酐、尿白蛋白水平,试剂盒检测谷胱甘肽(glutathione,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平。HE、PAS染色观察各组大鼠肾组织病理变化;Lillie染色检测肾组织内Fe~(2+)含量;Western Blot检测铁死亡蛋白GPX4、Tf R1、ACSL4表达水平,检测炎症因子PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6、TNF-α表达水平,检测Nrf2、HO-1、NQO1表达水平。细胞实验:以HK2细胞为研究对象,使用高糖(high glucose,HG)(30 mmol/L)干预HK2细胞24 h造DN模型,随后使用HG联合Erastin、Fer-1、GSPE、DFO和si-Nrf2干预HK2细胞,CCK-8试剂盒评估细胞活力,荧光探针试剂盒检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,使用JC-1试剂盒检测细胞的线粒体膜电位,PI染色评估细胞存活情况,Lillie染色检测细胞内Fe~(2+)含量,试剂盒检测MDA、GSH、SOD水平,Western Blot法检测铁死亡蛋白(GPX4、Tf R1、ACSL4)表达水平,炎症因子(PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α)表达水平,Nrf2信号通路蛋白(Nrf2、HO-1、NQO1)表达水平。结果:1.高糖高脂饲料联合链脲佐菌素喂养大鼠下,与正常对照组大鼠相比,DN组大鼠出现多饮多尿和体重减轻的症状,血尿素氮、血肌酐和尿白蛋白水平显著升高(P<0.05);HE和PAS染色发现,DN大鼠肾组织中肾小管结构不完整,基质有增生,系膜扩张;此外,DN大鼠肾组织中MDA的水平显著升高(P<0.05),而SOD和GSH的水平降低(P<0.05)。而GSPE和Fer-1干预后,与DN组比较,大鼠多饮多尿和体重减轻症状有所缓解,尿素氮、血肌酐和尿白蛋白水平下降(P<0.05),大鼠肾组织病理损伤得到改善,肾小管损伤得到缓解,基质增生减少,系膜扩张程度减轻;大鼠肾组织MDA水平下降,SOD和GSH水平升高。2.与DN组比较,GSPE和Fer-1干预后,大鼠肾组织铁过载减轻,Tf R1、ACSL4、PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α水平降低(P<0.05)。DN组大鼠肾组织内Nrf2途径被抑制,Western Blot结果显示肾组织Nrf2、HO-1和NQO1水平降低(P<0.05)。而GSPE和Fer-1在一定程度上缓解了肾组织Nrf2、HO-1和NQO1水平降低(P<0.05)。3.与正常对照组细胞比较,HG和Erastin分别处理HK2细胞24 h后,细胞活性显著降低(P<0.05),细胞死亡率增加,GSH、SOD下Compound C降,MDA上升(P<0.05),Lillie染色结果显示Gender medicine细胞内Fe~(2+)含量增加(P<0.05),荧光探针检测细胞内ROS增加(P<0.05),JC-1试剂盒检测细胞内线粒体膜电位下降,Western Blot结果显示细胞内ACSL4和Tf R1表达水平显著升高(P<0.05),GPX4水平下降(P<0.05),PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05),Nrf2、HO-1和NQO1水平下降(P<0.05)。4.与HG组细胞比较,GSPE、Fer-1、DFO联合HG干预细胞后,细胞活力显著升高(P<0.05),GSH、SOD水平上升(P<0.05),MDA水平下调(P<0.05),Fe~(2+)含量增加和ROS积累得到改善(P<0.05),细胞内线粒体膜电位有所上升,Western Blot结果显示ACSL4、Tf R1、PTGS2、HMGB1、IL-1β、IL-6和TNF-α水平下降(P<0.05),GPX4的水平上升(P<0.05)。此外,细胞LY-188011溶解度内Nrf2通路相关蛋白Nrf2、HO-1和NQO1水平升高(P<0.05)。5.与HG+GSPE组细胞比较,HG+GSPE+si-Nrf2组细胞特异性的抑制Nrf2后,细胞内氧化应激水平升高,MDA水平增加(P<0.05),SOD和GSH水平降低(P<0.05),细胞内ROS水平增加(P<0.05),细胞存活率降低(P<0.05),Western Blot结果显示GPX4水平降低(P<0.05),ACSL4和Tf R1水平升高(P<0.05),细胞内Nrf2通路相关蛋白Nrf2、HO-1和NQO1水平降低(P<0.05)。结论:铁死亡加剧了DN大鼠肾组织损伤和HG诱导的HK2细胞损伤,并且进一步促进炎症反应的发生;而GSPE可以拮抗DN大鼠肾组织和HK2细胞的铁死亡,抑制氧化损伤,改善肾功能,其机制可能是激活Nrf2/HO-1信号通路发挥保护作用。