小麦是一种重要的粮食作物,在世界各地广泛种植。随着全球变暖和大洋环流异常的持续,极端天气事件频繁发生,其中对小麦影响较大的就是灌浆初期低温。低温冷害导致了世界主要小麦种植区的小麦产量大幅下降。淀粉是小麦籽粒中主要的贮藏物质,约占籽粒重量的70～80%,淀粉的积累量和理化性质关乎小麦的品质形成。高通量测序技术目前被广泛应用于分析植物对非生物逆境胁迫响应的研究,然而目前有关灌浆初期低温条件下小麦颖果发育过程中淀粉积累基因调控特征尚不清楚。本研究基于三类高通量测序技术(RNA测序、miRNA测序、降解组测序)对灌浆初期低温条Taurine半抑制浓度件下小麦颖果淀粉积累相关的miRNA进行了研究,分析了 miRNA及其靶基因参与响应低温胁迫下淀粉积累的途径,在转录后水平上揭示出小麦颖果响应低温胁迫的调控机制,为小麦耐低温品种选育、抗逆基因发掘以及高效栽培提供新的理论支持。本论文主要研究结果如下:(1)灌浆初期低温对小麦颖果淀粉积累的影响在灌浆初期低温条件下,YM15直链淀粉含量较对照组显著下降,YN19直链淀粉含量也有下降趋势;YM15中支链淀粉含量显著上升,而YN19中则有下降趋势;YM15总淀粉含量有增加趋势,而YN19则呈下降趋势。两个品种小麦淀粉的膨胀势均显著增加。YM15低温处理组的大淀粉颗粒显著增多,但YN19低温处理组的小淀粉颗粒显著增多,但两个品TLC bioautography种小麦的胚乳充实度均降低。此外,低温处理使两个品种小麦的短链支链淀粉含量均有所增加,而中长链和长链含量则均有所下降。以上结果表明低温会影响小麦颖果中淀粉积累的过程。(2)灌浆初期低温下小麦颖果差异表达基因分析本研究利用高通量测序对低温胁迫下的小麦籽粒进行转录组测序,在YM15中鉴定出差异表达基因(DEGs)6440个,其中2361个基因上调,4079个基因下调;在YN19中鉴定出DEGs共7842个,其中3820个基因上调,4022个基因下调。在YM15和YN19分别筛选出97个和117个与淀粉积累相关的候选基因。其中,有42个候选基因同时参与了 YM15和YN19两个品种小麦的淀粉积累相关过程。对这些候选基因进行筛选,在YM15和YN19中鉴定出GLGB、GLGB3、SSY3A、SSY22和SSG1B基因,分别编码SBEI、SBEI、SSSⅢ、SSSⅡ和GBSSI。通过对候选基因进行GO、KEGG富集分析,发现YM15和YN19均富集在1,4-α-葡聚糖分支酶活性、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解/糖代谢通路中。YM15中的候选基因的功能集中在葡萄糖结合、葡糖激酶活性、碳水化合物磷酸酶活性和β-葡萄糖苷酶活性等生物过程中;YN19中候选基因的功能富集在淀粉生物合成、淀粉酶活性、碳水化合物磷酸酶活性和葡聚糖分解代谢过程等生物过程中。(3)灌浆初期低温下小麦颖果miRNA的差异表达分析本研究采用高通量miRNA测序技术,分析了 YM15和YN19两个品种小麦的低温处理组和正常生长对照组4个sRNA文库,共获得321.56 M Raw Reads,片段长度在18-32 nt范围内呈正态分布,其中以24 nt的sRNA丰度最高。共鉴定出217个miRNA,其中有117个新miRNA和100个已知miRNA隶属于33个miRNA家族。本研究在YM15和YN19中分别鉴定出14个和27个差异表达miRNA,其中,YM15中共有10个上调,4个下调,YN19中共有19个上调,8个下调。在YM15和YN19这些差异表达的miRNA中分别筛选出6个(1D_128_254662315_254662335、5A_71_116585637_116585657、5D_546_110367926_110367946、tae-miR9657b-5p、tae-miR531、tae-miR9659-3p)、2 个(5D_546_110367926_110367946、tae-miR531)与淀粉积累相关的miRNA。(4)灌浆初期低温下小麦颖果miRNA-靶基因的降解组测序验证本研究以YM15和YN19为材料,构建降解组文库并进行深度测序,结合前期利用miRNA测序获得小麦响应低温胁迫的miRNA序列信息对降解组数据进行生物信息学分析,并筛选出与淀粉积累相关的基因,在YM15和YN19中分别筛选出42个和29个候选基因。YM15中上调表达的基因有15个,下调表达的基因有27个;YN19中上调表达的基因有15个,下调表达的基因有14个。其中,有7对miRNA-靶基因参与了淀粉的积累。通过对候选基因的GO功能显著性富集分析发现,在两个品种小麦中均富集到的GO条目有:淀粉结合和多糖代谢过程。此外,在YM15中这些靶基因富集的条目还有糖原(淀粉)合酶活性、海藻糖和葡聚糖的合成代谢等;在YN19中这些靶基因富集的条目还有葡萄糖基转移酶和水解酶活性以及葡萄糖、多糖和淀粉的合成和代谢途径等。通过KEGG通路富集分析发现,YM15和YN19中响应低温胁迫miRNA的靶基因显著性富集在戊糖和葡萄糖醛酸转换、淀粉、蔗糖、半乳糖、果糖和甘露糖代谢以及糖酵解/糖代谢和磷酸戊糖途径等途径中。综上所述,本研究通过对灌浆初期低温下两个品种小麦颖果的基因和miRNA差异表达分析,共鉴定出7对可能参与小麦低温胁迫下的淀粉积累的miRNA-靶基因对,其中,在YM15中,鉴定出7对miRNA-靶基因对与淀粉积累密切相关,包括1D_128_254662315_254662335-HXK3、tae-miR确认细节531-SSY23、tae-miR531-INV2、tae-miR9657b-5p-GLGS2、tae-miR9659-3p-SSY3A、5A_71_116585637_116585657-SUS 和5D_546_110367926_110367946-SUS2,在 YN19 中则鉴定出 2 对 miRNA-靶基因对(5D_546_110367926_110367946-SUS2,tae-miR531-INV2)与淀粉积累密切相关。以上研究结果不仅能深化小麦籽粒淀粉积累响应温度的分子机制研究,而且对耐寒小麦品种的分子选育提供了理论支撑。