目前集约化草鱼养殖(Ctenopharyngodon idellus),因投喂不当、饲料中营养不均衡、滥用抗生素等原因引起的草鱼营养性脂肪肝已成为困扰草鱼养殖产业的一大难题。营养性脂肪肝可导致减缓鱼体生长速度,提高饵料系数,降低抗应激能力和免疫力,因不耐高温而引起草鱼暴发性死亡。近几年,随着对miR-27b深入的研究,研究发现miR-27b在抑制脂肪积累,促进脂肪分化等方面发挥重要作用。因此,本研究拟以草鱼L4428肝细胞系为实验材料,通过构建草鱼体外高脂模型,确定miR-27b与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)是否存在靶向关系,探究miR-27b与共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)在L8824肝脏脂肪代谢中的调控机制,以期为草鱼营养性脂肪肝的防治和深层次的研究提供理论参考。1.构建草鱼L8824肝细胞系高脂模型为筛选草鱼肝细胞高脂模型的最佳油酸浓度,并分析油酸(Oleic acid,OA)引起草鱼肝细胞脂质代谢的作用机制,以草鱼L8824肝细胞为研究对象,建立草鱼肝细胞高脂模型。以完全培养基(90%的M199、10%的胎牛血清和1%的青链霉素)为对照组不含油酸,处理组为含0.25 mmol/L OA组、0.50 mmol/L OA组、0.75 mmol/L OA组、1.00 mmol/L OA组、1.25 mmol/L OA组和含10%胎牛血清的诱导培养液,孵育时间为24 h、48 h和72 h,培养温度为28℃,检测细胞存活率及观察脂滴积聚情况,检测细胞中谷丙转氨酶(lanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)、γ-谷氨酰胺转肽酶(γ-Glutamine transpeptidase,γ-GT)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutaSAHAse,SOD)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、胆固醇(Total cholesterol,TC)、总蛋白(Total protein,TP)等脂质代谢相关的活性,RT-PCR技术检测脂代谢关键基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ、过氧化物酶体增殖物激活受体α、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FAS)、脂蛋白酯酶(Lipo protein lipase,LPL)、乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-Co A carboxylase,ACC)、解偶联蛋白(Unconpling protein 2,UCP2)、瘦素(Leptin,Lep)、固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding protein-1New microbes and new infectionsc,SREBP-1c)的转录水平变化。结果发现,0.50 mmol/L油酸处理48 h的细胞存活率显著高于其他组(p<0.05),且细胞的脂滴最大,细胞状态最佳。在草鱼肝细胞高脂模型中,含0.50 mmol/L油酸浓度孵育48 h后PPARγ、PPARα、FAS、LPL和UCP2等脂代谢基因的表达量显著升高(p<0.05),而ACC、Lep和SREBP-1c基因表达量差异不显著。表明含0.50 mmol/L油酸浓度孵育48 h可建立草鱼营养性脂肪肝细胞模型。结论认为:采用0.50 mmol/L油酸浓度孵育48 h可成功建立草鱼肝细胞高脂模型;肝细胞内脂肪积累可能与PPARγ、PPARα、FAS、ACC、SREBP-1c、LPL、Lep和UCP2等脂肪代谢关键基因密切相关。2.MiR-27b对PPARγ的验证本试验使用萤光素酶报告基因检测MiR-27b对PPARγ靶基因的沉默。实验程序首先包括克隆萤火虫荧光素酶报告分子下游的MiR-27b预测的m RNA靶标的3'UTR的野生型和突变形式。接下来,将miR-27b mimic和pmir GLO-PPARγ-3'-UTR一起共转染到KEK293T细胞中,并监测报告基因的表达。萤光素酶水平的变化将表明miRNA是否可以与UTR结合并调节其表达。结果显示,通过PCR、双酶切和基因测序证明MiR-27b靶向调控PPARγ;在KEK293T细胞中,共转染处理组(共转染NC mimic+pmir GLO-PPARγ-3'UTR-WT)和对照(共转染NC mimic+pmir GLO-PPARγ-3'UTR-NC)细胞均检测到荧光素酶酶活性,两组活性不显著。对照组(共转染miR-27b mimic+pmir GLO-PPARγ-3’UTR-NC)和处理组(共转染miR-27b mimic+pmir GLO-PPARγ-3’UTR-WT)细胞均检测到荧光素酶活性,但对照组酶活性显著高于处理组(p<0.05)。miR-27b mimic显著下调了pmir GLO-PPARγ-3'UTR荧光素酶报告载体的报告荧光,说明PPARγ应是miR-27b的靶基因。本实验证实草鱼PPARγ是miR-27b的直接靶基因,miR-27b通过和PPARγm RNA 3'UTR结合可调控PPARγ基因的表达和调控。3.miR-27b对CLA发挥降低草鱼肝脂积累功效的调节作用探讨miR-27b对CLA在草鱼L8824肝细胞中发挥降脂功效的机制和作用。实验分组分别为:0.50 mmol/L OA模型细胞、模型细胞+50μM CLA、模型细胞+EGFR抑制剂50μM CLA+NC mimic、模型细胞+50μM CLA+miR-27b mimic、模型细胞+50μM CLA+NC inhibitor、模型细胞+50μM CLA+miR-27b inhibitor,培养时间为24 h、48 h和72 h,培养温度为28℃,通过检测细胞存活率和RT-PCR检测PPARγ、PPARα、FAS、ACC、SREBP-1c、LPL、Lep和UCP2等脂代谢相关基因的表达量来观察miR-27b对CLA在L8824细胞中的降脂影响。结果显示:CLA降脂最佳时间是转染24 h后,CLA可显著下调PPARγ、PPARα、FAS、LPL和SREBP-1c基因的表达量(p<0.05),而ACC则在转染48 h后显著下调(p<0.05);miR-27b抑制脂肪沉积最佳时间是转染48 h后,miR-27b过表达可显著下调PPARγ、PPARα、FAS、LPL、ACC和SREBP-1c等脂代谢相关基因的表达量(p<0.05),而Lep无明显变化;miR-27b抑制剂可显著上调PPARγ、PPARα、FAS、LPL、ACC、Lep和SREBP-1c等脂代谢相关基因的表达量(p<0.05)。说明miR-27b可通过调节脂代谢相关基因的表达量进而达到抑制脂肪合成目的。综上所述:本研究构建了0.50 mmol/L油酸浓度诱导草鱼肝细胞脂肪变性高脂模型;证实了草鱼PPARγ是miR-27b的直接靶基因,可调控PPARγ基因的转录后表达;验证了miR-27b对CLA转染48 h后可抑制L8824肝细胞脂肪沉积,促进脂肪细胞分化。