心力衰竭(Heart failure,HF)是一种复杂的临床综合征,由心室收缩或舒张功能障碍引起。全世界每年有超过100万名患者因心力衰竭入院治疗。心力衰竭是许多心脏病的最后阶段。心力衰竭的病理生理机制涉及多种因素,包括心肌细胞凋亡、线粒体功能障碍、氧化应激、炎症和钙超载等。值得注意的是,心肌细胞凋亡仍然是心力衰竭的主要原因。在终末期心力衰竭患者和实验性心力衰竭大鼠中均观察到心肌细胞凋亡增加。抑制心肌细胞凋亡可能会阻止心脏重塑和保护心脏功能。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)会导致心力衰竭和心肌细胞凋亡。Ang II会触发多种信号通路,如MAPKs、PI3K/Akt和NADPH氧化酶。所以Ang II通常用于建立心力衰竭动物模型。复方苦参注射液(Compound Kushen Injection,CKI)是一种中药(Traditional Chinese medicine,TCM)制剂,从苦参(Radix Sophorae Flavescentis)和土茯苓(Rhizoma Smilacis Chinae)中提取。CKI的活性成分由苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱、槐定碱、槐碱和苦参黄素组成。现代研究证实了CKI的众多药理特性,包括抗肿瘤、增强免疫力、镇痛和抗炎等,广泛用于治疗各种恶性肿瘤,包括乳腺癌、肺癌、肝癌等。几十年来,它一直单独使用或与化疗或放疗联合使用。近年来,多项研究证明CKI也与心脏保护功能有关。CKI可减轻蒽环类药物引起的心脏毒性,改善患者的心功能。然而,其机制并不清楚。如果CKI能够在治疗癌症的同时减轻心力衰竭,那将具有重要的临床意义。作为CKI的主要活性成分之一,苦参碱的心脏保护作用已被广泛报道。苦参碱具有正性肌力作用、负性变时作用和负性自动作用,可减轻心肌损伤。以往的研究表明,苦参碱可以通过调节PI3K/Akt通路来减轻血管损伤。此外,苦参碱通过调节Bcl-2/Bax表达和激活半胱天冬酶3(Caspase3)改善Ang II介导的心肌纤维化。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)家族参与多种信号通路并调节细胞增殖、分化、存活和凋亡。PI3K/Akt通路被认为是心肌细胞凋亡的主要信号通路。增加PI3K表达将导致心肌细胞凋亡并最终导致心室收缩和舒张功能受损。有研究证实可以通过调控PI3K/Akt通路抑制心肌细胞凋亡,从而达到对心力衰竭的保护作用。为了探讨CKI是否能够改善心力衰竭,并探索其作用机制,为临床应用提供支持。本实验首先观测CKI对心力衰竭患者的影diABZI STING agonist临床试验响。接着,我们将使用CKI对心力衰竭模型小鼠进行药物干预,观察CKI对心衰小鼠心功能的影响,并探索其作用机制。第一部分复方苦参注射液改善心力衰竭患者心功能的研究目的:探究复方苦参注射液对心力衰竭患者心功能的影响。方法:1.收集于2021年3月～2022年12月在河北医科大学第一医院肿瘤科住院的40例心力衰竭患者,分为对照组(常规心力衰竭治疗组,CON)20例和观察组(常规心力衰竭治疗加CKI治疗组,CKI)20例。入组前患者本人均同意并签署知情同意书。以上所有实验过程均由河北医科大学第一医院伦理委员会批准。2.观察组每次以20ml CKI静滴,每天1次,连续应用21天。然后比较两组患者治疗前与治疗后的血清NT-pro BNP,心脏彩超测定LVEF,6MWT试验等相关指标。3.采用Graphpad Prism(版本8.0)软件进行统计学分析。连续变量符合正态分布时以均数±标准差(mean±SD)表示,不符合正态分布时以中位数(四分位间距)表示。分类变量以例数(百分比)表示。两组间比较采用独立样本t检验,均采用双侧检验,分类变量采用卡方检验。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.实验结果显示,CKI组患者血清中的NT-pro BNP的表达量较对照组患者显著降低(P<0.05)。2.心脏彩超提示CKI干预组LVEF较对照组显著升高(P<0.05)。3.采用6MWT检测对照组及观察组患者6分钟步行的距离,结果显示,CKI干预后步行距离明显升高(P<0.05)。小结:复方苦参注射液干预组NT-pro BNP的表达水平与对照组相比呈降低趋势,LVEF水平与对照组相比呈升高趋势,6MWT试验的步行距离明显增加。因此,证明复方苦参注射液可以改善心力衰竭患者的心功能。第二部分复方苦参注射液对由血管紧张素II介导的心力衰竭模型小鼠的影响目的:使用CKI对心力衰竭小鼠进行药物干预,从血流动力学、超声心动图、生物标志物、心肌结构、心肌细胞凋亡率等方面证实CKI对心力衰竭小鼠有保护作用。方法:1.选取实验动物。本实验选取6周龄、体重20-22 g的雄性C57BL/6小鼠,小鼠购自Skbex Biotechnology(中国),笼养在12:12光暗循环的笼子里,自由饮水和饮食。2.建立心力衰竭动物模型及分组。小鼠随机分为四组:对照组(CON)采用假手术,皮下注射磷酸盐缓冲液(PBS),剂量为300μl/kg/天(n=10);CKI组(CKI),进行假手术,每日皮下注射CKI(300μl/kg/天)(n=10);Ang II组(Ang II),进行Ang II手术,每天皮下注射PBS(300μl/kg/天)(n=10);Ang II加CKI组(AC),进行Ang II手术,每天皮下注射CKI(300μl/kg/天)(n=10)。PBS或CKI每天皮下注射一次,持续3周。小鼠在手术前通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kgviral immunoevasion)进行麻醉。然后使用渗透性微型泵加入Ang II(2μg/https://www.selleck.cn/products/PD-0325901.htmlkg/min)。微型泵皮下植入小鼠背部皮肤,共21天。同时,假手术小鼠接受相同的操作,泵中放置200μl PBS。3.采用血流动力学和超声心动图测定左心室收缩末期直径(LVDS)、左心室舒张末期直径(LVDD)、LVEF以及左心室缩短分数(LVFS)的变化。4.采用酶联免疫吸附试验测定心肌肌钙蛋白I(c Tn I)和NT-pro BNP的血清水平。5.使用透射电镜观察心肌切片的超微结构改变。6.采用流式细胞检测心肌组织内凋亡细胞含量。7.采用TUNEL法测量心肌凋亡细胞的凋亡指数。8.所有数据均以平均值±平均值的标准误差(M±SEM)的形式呈现。使用Graphpad Prism(版本8.0)计算机程序评估结果,并使用单向变量分析(ANOVA)对所有对照和治疗小鼠的差异进行分析。组间比较使用Tukey检验进行。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.CKI改善心脏顺应性。通过多普勒超声检查评估左心室大小及其功能。Ang II组的LVEF值明显低于其他组,AC组的LVEF值明显高于Ang II组(P<0.001)。LVFS也呈现类似趋势,与AC组相比,Ang II组的LVFS较低(P<0.001)。与Ang II组相比,CKI联合治疗降低了LVDS(P<0.01)。然而,每两组之间的LVDD没有显著差异。这些结果表明CKI减轻Ang II介导的心衰小鼠的心功能损伤。Ang II介导的小鼠表现出较低的收缩功能,但CKI干预后显著改善了心室的收缩功能。2.CKI减少心肌损伤。与CON组相比,Ang II组c Tn I显著增加(P<0.001)。与Ang II组相比,AC组c Tn I的水平显著降低(P<0.01)。AC组小鼠NT-pro BNP的血浆水平明显低于Ang II组(P<0.01)。CKI组和CON组的NT-pro BNP水平显著降低(P<0.01)。结果证实,CKI降低了Ang II诱导的心肌损伤。3.CKI缓解心肌损伤。心肌的超微结构由透射电镜图像显示,正常对照小鼠和CKI治疗小鼠的透射电镜图像显示心肌细胞线粒体均匀分布在整个细胞中,保持其正常形状、致密嵴、完整的膜,以及心肌纤维排列有序,Z线清晰。Ang II组表现为心肌细胞水肿,心肌细胞膜出现多种形式的损伤,心肌纤维排列不规则,严重断裂;并且还观察到线粒体有弥漫性肿胀,大小不一,可见多个空泡,嵴破裂、裂解和空泡化。AC组的小鼠心肌细胞内线粒体无肿胀,嵴轻度受损,肌原纤维正常,心肌纤维排列整齐,Z线清晰。Ang II组中心肌细胞肥大、水肿和线粒体损伤率明显高于AC组。4.CKI减少心脏组织凋亡。TUNEL检测表明,连续输注Ang II可显著增加TUNEL阳性细胞。AC组TUNEL阳性细胞减少。AC组与Ang II组相比,细胞凋亡率呈下降趋势(P<0.001)。TUNEL实验显示CKI显著降低了心肌组织的凋亡率。5.流式细胞学结果表明,CKI抑制了左心室的心肌细胞凋亡。在Ang II组中,代表晚期凋亡细胞的右上方形(Annexin V-PE+/7-AAD+)的数量与CON组相比明显增加(P<0.001)。类似地,代表早期凋亡细胞的右下方形(Annexin V-PE+/7-AAD-)的细胞数量在Ang II组中显著增加(P<0.01)。然而,在AC组中,右上方形(Annexin V-PE+/7-AAD+)和右下方形(Annexin V-PE+/7-AAD-)的数量与Ang II组相比显著下降。总细胞凋亡率,包括早期细胞凋亡率和晚期细胞凋亡率,在AC组中也有所降低(P<0.001)。小结:CKI可以改善心衰小鼠的心脏功能;CKI可以减少线粒体损伤,减轻心肌结构破坏,阻止心脏结构重塑,降低心肌细胞凋亡率,对小鼠心脏功能起到保护作用。第三部分复方苦参注射液通过调控PI3K/Akt通路减轻血管紧张素II介导的心力衰竭目的:从体内、体外两个角度进一步阐述CKI治疗心力衰竭小鼠的作用机制,证明CKI可以通过调控PI3K/Akt凋亡通路来减轻Ang II介导的心力衰竭。方法:1.选取实验动物。本实验选取6周龄、体重20-22 g的雄性C57BL/6小鼠,小鼠购自Skbex Biotechnology(中国),笼养在12:12光暗循环的笼子里,自由饮水和饮食。2.建立心力衰竭动物模型及分组。小鼠随机分为四组:对照组(CON)采用假手术,皮下注射PBS,剂量为300μl/kg/天(n=10);CKI组(CKI),进行假手术,每日皮下注射CKI(300μl/kg/天)(n=10);Ang II组(Ang II),进行Ang II手术,每天皮下注射PBS(300μl/kg/天)(n=10);Ang II加CKI组(AC),进行Ang II手术,每天皮下注射CKI(300μl/kg/天)(n=10)。PBS或CKI每天皮下注射一次,持续3周。小鼠在手术前通过腹腔注射戊巴比妥钠(40 mg/kg)进行麻醉。然后使用渗透性微型泵加入Ang II(2μg/kg/min),共200μl。微型泵皮下植入小鼠背部皮肤,共21天。同时,假手术小鼠接受相同的操作,泵中放置200μl PBS。3.用Western blot方法法检测心肌细胞PI3K、Bax、cyto C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3、p Akt和Bcl-2的蛋白表达情况。4.细胞培养。H9C2细胞系购自中国细胞系资源基础设施中心(中国医学科学院基础医学研究所)。将H9C2细胞(3×10 4细胞/ml)接种在96孔板中,在37?C下孵育48小时,随后分为三组:对照组用PBS(PBS 100μl)处理,Ang II组用Ang II(PBS 50μl,Ang II 50μl)处理,AC组用Ang II联合CKI(Ang II 50μl,CKI 50μl)处理。Ang II(1μmol/l),使用最终浓度为2 mg/ml总生物碱的稀释CKI。5.分别进行CCK-8测定、FCM和Western blot分析,以检测细胞活力、细胞周期分布和代表性信号蛋白的表达情况。6.所有数据均以平均值±平均值的标准误差(M±SEM)的形式呈现。使用Graphpad Prism(版本8.0)计算机程序评估结果,并使用单向变量分析(ANOVA)对所有对照和治疗组的差异进行分析。组间比较使用Tukey检验进行。P<0.05被认为具有统计学意义。结果:1.小鼠心肌组织WB结果显示,CKI降低促凋亡蛋白的表达,包括PI3K、Bax、cyto C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3,同时显著增加p Akt和Bcl-2的表达。2.CCK-8检测结果显示,Ang II显著降低了H9C2细胞活力(P<0.001),而在CKI(P<0.05)处理后,H9C2细胞活力升高。3.FCM显示,在H9C2细胞中,Ang II增加了G1期细胞周期阻滞(P<0.01),减少了S期细胞周期阻滞(P<0.01)。CKI处理后,G1期细胞百分比下降(P<0.01),G1期细胞周期阻滞下降。此外,S期细胞百分比增加(P<0.01)。4.体外WB实验结果显示,CKI显著降低了H9C2细胞中PI3K、Bax和p27的表达水平。此外,AC组中p Akt、Bcl-2和cyclin D1组的表达水平显著升高。小结:CKI可以通过调控PI3K/Akt凋亡通路来减轻Ang II介导的心力衰竭,显著的降低促凋亡蛋白的表达,包括PI3K、Bax、cyto C、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3,同时显著增加p Akt和Bcl-2的表达。CKI可以抑制G1期的细胞阻滞,减少心肌细胞凋亡,增加心肌细胞活力。