研究背景与目的:纳米技术和微针在经皮给药领域中是研究的热点,二者的联合应用可产生协同作用,在不损伤皮肤的前提下提升药物的经皮转运,促进药物的高效应用。目前,纳米技术和微针联合应用尚处于初级阶段,面临着如微针针体不能有效插入皮肤造成药物输送効率低下、微针与纳米载体材料在皮肤中降解引起副作用等诸多的挑战。为研究纳米技术和微针的联合应用问题,本课题以水杨酸(Salicylic acid,SA)为模型药物,首先将SA包裹进脂质体(Liposomes,LIP),然后负载于可溶性微针(Dissolvable Microneedles,DMNs)中制成水杨酸脂质体可溶性微针(SA-LIP-DMNs),并对SA-LIP-DMNs进行机械强度、穿刺性能、针对轻中度痤疮的药效学试验、皮肤刺激性等评价,为纳米技术和微针的联合应用作进一步研究,同Tofacitinib时也为脂质体联合微针给药技术治疗痤疮提供范例。材料与方法:1.SA-LIP的制备及质量评价通过文献专利及前期预实验建立SA的含量测定方法,考察SA-LIP包封率测定方法,考察SA-LIP制备方法;通过单因素试验以及响应面面法对处方工艺中的类脂比、药脂比、醋酸钙浓度、孵化时间、孵化温度等因素进行筛选优化;通过马尔文激光粒度仪和透射电镜对脂质体的粒径、外观形态和物理状态进行表征;通过考察体外释放度、放置过程中的稳定性变化对SA-LIP进行质量评价;2.SA-LIP-DMNs的制备及质量研究采用浇筑法和真空法制备SA-LIP-DMNs,以SA-LIP-DMNs的外观形态、含针率为指标,结合制备过程中的基质材料溶解时间、溶液气泡量、脱模难易程度等重要因素,对处方工艺中的基质材料种类和干燥工艺等进Remediation agent行优化;通过扫描电镜、质构仪对SA-LIP-DMNs的外观形态、穿刺性能、机械强度进行表征selleck MK-1775;通过测定SA含量、体外释放、体外透皮、皮肤滞留量对SA-LIP-DMNs进行质量研究;3.SA-LIP-DMNs对小鼠轻、中度痤疮的药效学评价通过皮下注射痤疮丙酸杆菌同时涂抹油酸的方式,建立小鼠痤疮病理模型,并以表观形态指标和病理学指标判断造模成功与否;通过对比治疗后各组的表观形态学指标和病理学指标,评价治疗效果;通过各组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8四种炎症因子治疗后的浓度作为评价指标,比较各组对炎症因子的抑制水平;通过采用自身对照法,评价SA-LIP-DMNs的皮肤刺激性。结果:1.SA为白色结晶性粉末,常温下微溶于水,饱和溶解度约为1.8 mg/mL,常温常压下性质稳定,见光颜色逐渐变深,在303 nm下有较强的紫外吸收,因此确定以HPLC法测定SA含量;脂质体常见的包封率测定方法为柱层析法、超滤离心法、透析法,柱层析法准确性高、重复性好,因此采用柱层析法测定脂质体包封率;前期脂质体制备方法筛选的结果显示,被动载药法制备得到的制备包封率整体偏低,而醋酸钙主动载药法则相对偏高,因此确定以醋酸钙主动载药法制备SA-LIP;通过单因素试验和响应面法优化处方工艺,得到的最佳SA-LIP制备工艺如下:(1)薄膜分散法初步制备空白LIP称取大豆卵磷脂1260 mg、胆固醇217.2 mg置于500 mL烧瓶中,加入适量无水乙醇使其溶解,再加入适量玻璃珠(粒径6 mm),于35℃下旋蒸使其干燥成膜,加入30 mL150 mmol/L醋酸钙溶液洗下薄膜,初步得到空白LIP,备用;(2)空白LIP整粒取(1)中空白LIP,经高压均质处理(控制压力为400 bar,均值次数在8-12次),得到粒径分布均匀的空白LIP,带有淡蓝色乳光;(3)建立空白LIP的pH梯度取(2)中空白LIP透析建立pH梯度,选择分子截留量为8000-12000 Da的透析袋,以150 mmol/L的无水硫酸钠溶液为透析液,按1:20的比例在25℃下进行透析,每1 h更换一次透析液,共透析3次,得到膜内外pH梯度大于3的空白LIP。(4)空白LIP载药称取SA 63 mg加入至(3)中空白LIP,(加入前空白LIP 50℃保温,并保持300 rpm使两者混合均匀),在50.8℃下孵化15.8 min,即得SA-LIP,冷藏备用。制备得到的SA-LIP外观呈类球形,大小分布均匀,粒径约120 nm,PDI多分散系数约0.188;4℃条件下储存一周内的粒径变化、渗漏率较低,稳定性良好;水杨酸脂质体体外释放结果显示,相比于SA原料药,60 min内SA-LIP的释放量约为原料药的50%,显著降低了SA的释放速率。2.通过对基质材料的筛选和干燥工艺的考察,得到的最佳SA-LIP-DMNs制备工艺如下:(1)SA-LIP-DMNs聚合物溶液的配置取SA-LIP 20 mL,加入PVP K30、透明质酸各500 mg,轻微搅拌使其分散均匀,静止2 h使其充分溶胀,备用;(2)倒入模具取PDMS模具,加入0.5 mL(1)中聚合物溶液,放置于真空干燥箱中,常温抽真空至负压为-0.07 MPa,维持5 min后取出,刮去模具表面有气泡的聚合物溶液,另取聚合物溶液至模具中,按上述抽真空步骤重复三次,向模具中定量加入1.2 mL聚合物溶液,备用;(3)干燥脱模取(2)中带有聚合物溶液的PDMS模具,放置于鼓风干燥箱中,30℃下干燥6h,小心脱模取下SA-LIP-DMNs,即得。制备得到的SA-LIP-DMNs边长为1.5 cm,片重为106.86±4.64 mg,针体约为400μm,针体底座呈正方形,宽度约为300μm,针体间距约为600μm,外观整体良好,针体排列规格整齐,含针率高;原辅料相容性试验结果显示,用于制备的SA-LIP-DMNs辅料不会引起SA的杂质增多,可用于SA-LIP-MNs的制备,但结果显示高温和光照均会引起SA不同程度的降解,因此在后续的制备过程中应尽量避免高温和光照条件;机械强度和离体皮肤穿刺性能测试结果显示表明SA-LIP-DMNs具备足够的强度和韧性,能够穿透皮肤角质层;SA-LIP-DMNs体外透皮试验结果表明,SA-LIP-DMNs组在24 h的单位面积累积渗透量为191.43±16.42μg/cm~2,SA-LIP-DMNs组的总滞留量为143.69μg,SA-LIP-DMNs组的透过量和皮肤滞留量均大于凝胶组和软膏组;SA-LIP-MNs体外释放试验结果表明,SA-LIP包裹和DMNs负载后,显示出了双重缓释效果;3.采用皮下注射痤疮丙酸杆菌和涂抹油酸在小鼠背部建立痤疮动物模型,根据造模后的表观指标和病理学指标可知,该造模方法成功建立了小鼠痤疮模型。对痤疮模型小鼠进行分组给药治疗14天后,分别对各组小鼠皮肤外观形态、病理学指标和血清炎症因子的水平进行比较,从外观形态和病理学指标结果可知,SA-LIP-DMNs组的疗效比较显著,主要体现在减轻局部皮肤角质化程度、减少局部组织充血等方面;从血清炎症因子的水平上看,通过给药治疗后,SA-LIP-DMNs组相比于模型组显著降低了炎症因子水平,并且等效于阳性药物对照组,说明SA-LIP-MNs能够有效抑制痤疮引起的炎症反应,从而起到治疗痤疮的作用。结论:本研究选择生物可降解、相容性良好、无免疫原性的大豆卵磷脂、胆固醇、PVP K30和HA作为辅料,采用脂质体和可溶性微针相结合的方式制备了SA-LIP-DMNs,其具有足够的机械强度和韧性刺穿皮肤角质层到达皮下,可显著提高SA的经皮渗透能力并减缓SA的释放而使SA-LIP-DMNs到达病灶缓慢释放SA,减轻了治疗过程中SA的刺激性、减少了给药次数,针对轻、中度痤疮的药效试验结果表明SA-LIP-DMNs能显著降低炎症因子的表达,有利于病理部位皮肤的自我修复,对轻、中度痤疮具有显著的疗效。SA-LIP-DMNs为纳米技术和微针联合应用的进一步研究提供了依据,也为痤疮的临床治疗方案提供了新方案。