目的胶原蛋白作为一种独特的生物材料,具有较低的免疫原性、较高的生物相容性和修复功能,因此被广泛运用于医疗、保健、美容等领域。传统胶原蛋白的提取主要以动物皮肤为原材料,而以动物跟腱作为原料的较少。我国不属于疯牛病疫区,牛资源安全且丰富,因此本课题以牛跟腱为原料,通过提取条件的筛选获得最佳提取工艺,并通过丁二酸酐与胶原蛋白的酰化反应,解决天然胶原蛋白在生理环境中溶解度差的问题,制备一种具有较好溶解度和组织修复功能的材料。方法1.本文通过单因素实验筛选牛跟腱胶原蛋白的最佳提取条件,通过氨基酸分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热变性温度、圆二色谱、红外光谱,分析胶原蛋白三螺旋结构与特征。2.用斑马鱼尾鳍再生和斑马鱼col1a1b基因的相对表达量实验来论证胶原蛋白SARS-CoV2 virus infection的促进组织再生功效;用十二烷基硫酸钠诱导斑马鱼炎症的模型来论证胶原蛋白的抗炎功效。3.通过单因素实验筛选丁二酸酐酰化胶原蛋白的最佳反应条件,并制备丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒。通过对丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的等电点、溶解时间的研究,分析丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的溶解度;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、热变性温度、圆二色谱、红外光谱,分析酰化后的胶原蛋白的三螺旋结构与特征。4.用新西兰兔评价皮肤刺激实验、白化豚鼠评价皮肤致敏试验、体外细胞毒性试验来论证丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒的安全性。结果1.牛跟腱胶原提取的最佳时间为72h,最佳温度为25℃,最佳用酶量为3%。通过氨基酸分析,其中GSK1120212临床试验特征性的强脯氨酸含量为13.5%;通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳得到牛跟腱胶原蛋白的分子量接近300kd,热变性温度为69.9℃;圆二色谱、红外光谱,均有胶原蛋白特征峰。斑马鱼尾鳍再生功效为23%,P<0.01;2.斑马鱼的col1a1b基因的相对表达量为1.27,P<0.01;斑马鱼抗炎功效为32%,P<0.01。3.丁二酸酐酰化胶原蛋白的最佳反应条件为pH9、反应温度为25℃、丁二酸酐的用量为20%。制备的丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒等电点为3.82,溶解时间为60s～90s,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量偏高,热变性温度为67.4℃;圆二色谱、红外光谱显示丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒均有胶原蛋白特征峰;4.动物实验研究丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒安全性的结果为丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒皮肤刺激性小、无致敏反应、无细胞毒性试验。结论本课题以牛跟腱胶原蛋白为研究对象,设计并优化了牛跟腱胶原蛋白的提取方案,获得了Ⅰ型胶原蛋白。并用热变性温度、圆二色谱、红外光谱等各项验证方法验证了制备的牛跟腱胶原蛋白具有三螺旋结构。用斑马鱼动物实验证明了牛跟腱胶原蛋白具有促进组织修复和抗炎的功效。通过丁二酸酐酰化胶原蛋白,获得了改性胶原蛋白。丁二酸酐酰化胶原蛋白等电点偏PF-6463922低,易溶解,溶解时间在60s～90s。并且同样用热变性温度、圆二色谱、红外光谱等各项验证方法,验证了制备的丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒仍然具有三螺旋结构,说明其主要生物活性保留。此外,用皮肤刺激实验、皮肤致敏实验、细胞毒性实验,证明了丁二酸酐酰化胶原蛋白冻干绒具有较高安全性。