玉Liproxstatin-1体内米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)及其衍生物是全球范围内污染最严重的霉菌毒素之一,由多种镰刀菌属在其次级代谢过程中产生,常存在于发霉的小麦、玉米及谷物副产品中,对食品安全和人类健康都造成了严重的安全隐患。近年来,降解ZEN的生物酶法逐渐兴起,其中ZEN内酯水解酶因其降解效率高、降解机理清晰及降解产物无毒等优势受到广泛关注。然而,目前已挖掘的ZEN内酯水解酶均呈现出一定的缺陷:(1)较低的最适温度(35-40℃),且仅在50℃培养几分钟就会完全失去活性,展现了较弱的热稳定性。(2)偏碱性的最适pH(8.0-10.0),且在低pH条件下极易发生变性和失活;特别地,当暴露于高酸性胃液时,ZEN水解酶会失去全部活性。(3)大规模生产的缺乏,目前ZEN内酯水解酶仍停留在实验室阶段,还未有成熟工艺以制成酶制剂应用于饲料工业和畜禽业中。因此,针对以上的问题和不足,本课题采取分子改造、固定化及高密度发酵等手段展开研究内容,现总结如下:(1)利用分子生物学手段并结合计算机辅助蛋白质设计引入突确认细节变以提高ZEN内酯水解酶的热稳定性。以ZHD101的蛋白晶体结构(PDB:3wzl)为模板进行分子动力学模拟,结果显示残基S162和S220具有最高的RMSF值。经饱和突变策略筛选后,单点突变体S162P和S220R酶均表现出热稳定性的提升及熔解温度(T_m)的增加。在此基础上,组合突变体S162P/S220R酶表现出热稳定性提高的协同效应,55℃条件下其半衰期(t_(1/2))增加了36.8倍,T_m值也显著提升了8.2℃,达到57.48℃。分子动力学模拟和蛋白结构分析表明,组合突变体S162P/S220R酶热稳定性的提高可能与其整体结构刚性增强、氢键数量增多及残基间形成盐桥有关。(2)采取分子改造及固定化手段提高ZEN内酯水解酶的耐酸稳定性。通过将ZEN内酯水解酶与由卡拉胶和氢氧化镁(Mg(OH)_2)构成的缓释体系进行共封装,使得其耐酸稳定性得到显著提升,实现高酸性环境下对ZEN的高效降解。在pH 5.0条件下,未共封装Mg(OH)_2的纯酶液活力低于40%,而共封装0.4%的Mg(OH)_2时,水凝胶珠内酶活性超过80%。在pH 4.0条件下,纯酶液活力低于5%,共封装0.4%Mg(OH)_2的水凝胶珠内仍具有40%的活力。(3)利用5 L和50 L发酵罐对发酵规模进行逐级放大,成功实现了ZEN内酯水解酶的高密度发酵生产。结果显示,发酵OD_(600)最高能够升Genetic exceptionalism至130,发酵酶活最高达到500U/m L。并通过喷雾干燥的方式将其粗酶液制备为酶制剂,显著提高了其储藏稳定性,为ZEN内酯水解酶的工业应用奠定了基础。