美国白蛾(Hyphantria cunea)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)、目夜蛾科(Erebidae),是我国重要的检疫性害虫。当前,美国白蛾的防治主要依赖于化学杀虫剂。但由于长期不规范使用,且美国白蛾自身具有食性杂、传播速度快、适应性强、繁殖力强等特点,导致对不同作用机制的杀虫剂易产生抗药性,同时伴随出现系列环境污染问题,因此亟需开发绿色、安全、高效的防治技术。基于几丁质在脊椎动物和植物中缺乏,同时又是昆虫外骨骼、中肠围食膜、马氏管等组织的重要成分,近年来人们将几丁质合成通路基因视为设计新型生物农药的潜在靶点。本研究以美国白蛾为对象,首先探究了外源胁迫与激素对几丁质合成的调控机制,其次对美国白蛾几丁质合成通路8个基因克隆分析,明确了相关基因的分子特性及m RNA表达谱,同时探究了HcGFAT和更多HcCHSA基因在美国白蛾几丁质合成中的功能,并对HcCHSA转录因子进行鉴定分析,主要研究结果如下:1.以美国白蛾为研究对象,在转录水平探究饥饿逆境对美国白蛾几丁质合成的调控作用。借助Illumina Novaseq?6000平台测序,共测得16755个Unigenes中有6464个注释到KEGG数据库,其中1699个基因注释到代谢途径中,主要参与碳水化合物代谢、脂代谢、氨基酸代谢和核苷酸代谢等代谢过程。此外,美国白蛾基因序列与粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)同源性最高为22.43%。与对照组相比,饥饿处理组共鉴定16389个差异表达基因(DEGs),其中上调表达基因6595个,下调表达基因9794个。大多数差异基因参与以几丁质为基础的角质层发育、角质层结构组分、细胞外基质以及ATP水解反应耦合的转运。此外,验证了饥饿导致ATP水平下降,进而激活AMPK,并通过提高己糖激酶相关基因表达,间接地促进了美国白蛾幼虫几丁质合成。2.保幼激素类似物苯氧威对美国白蛾幼虫具有毒杀活性,96 h亚致死浓度(LC_(30))为498.5μg/g。在苯氧威胁迫下,美国白蛾幼虫的生长发育受到抑制。同时中肠3种消化酶α淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性显著提高,并通过上调体内海藻糖浓度以抵抗苯氧威对其生理稳态的胁迫作用进而抑制几丁质合成酶基因(CHSA)的转录,并调控几丁质酶2基因(CHT2)上调表达,阻碍美国白蛾幼虫几丁质合成,导致幼虫体内几丁质含量显著显著下降。3.基于美国白蛾转录组数据,克隆获得美国白蛾几丁质合成通路中8个关键酶基因HcTre2、HcHK、HcG6PI、HcGFAT、HcGNA、HcPAGM、HcUAP和HcCHSA,并通过分子生物学软件和在线网站对8个由核苷酸序列推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。HcGFAT、HcGNA和HcCHSA均为不稳定蛋白,而在8个基因编码的氨基酸中,只有HcTre2和HcCHSA具有跨膜结构域。利用q RT-PCR技术明确美国白蛾几丁质合成通路8个基因在不同时空m RNA表达谱。结果显示,所有通路基因在美国白蛾1龄至蛹期均持续表达,但不同基因的转录水平存在差异。其中,HcTre2、HcHK、HcG6PI、HcGNA、HcPAGM、HcUAP在1龄和3龄表达量相对较高;HcTre2、HcG6PI、HcGFAT、HcGNA、HcPAGM和HcUAP 6个基因在蛹期的表达量均相对较低。此外,8个关键基因的表达虽有空间差异,但也存在共同趋势,HcTre2、HcG6PI、HcGNA和HcPAGM四个基因在脂肪体中呈现高表达,由此推测以上基因不仅参与了几丁质的合成,同时也参与了能量代谢。HcHK、HcG6PI、HcGFAT、HcGNA、HcPAGM、HcCHSA均在体壁中高表达,由此推测以上基因在体壁几丁质合成过程中发挥着重要作用。4.利用RNAi技术探究HcGFAT和HcCHSA在美国白蛾生长发育及几丁质合成过程中的作用。结果表明HcGFAT干扰后下调表达,导致美国白蛾幼虫的发育异常,同时调控其下游几丁质合成相关基因HcGNA、HcPAGM、HcUAP、HcCHSA下调表达,并阻碍幼虫体内几丁质合成。以上结果表明,HcGFAT不仅在美国白蛾幼虫的生长、蜕皮和变态中起关键作用,同时抑制下游medical chemical defense几丁质相关酶底物的转化,导致几丁质合成中断。而ds HcCHSA处理后美国白蛾化蛹率仅为12.2%,畸形率和死亡率升高,分别为81.67%和96.6%,并观察到5种畸形表型。此外,HcCHSA沉默导致体壁结构松散,且提高了美国白蛾对氯氟氰菊酯的敏感性。以上结果表明HcGFAT和HcCHSA基因在美国白蛾几丁质合成过程中发挥关键作用,能够作为防治美国白蛾的靶基因。5.通过在线预测网站对HcCHSA启动子片段进行分析,筛选出Br-C和Antp转录因子Erdafitinib供应商,并使用酵母单杂交技术进行转录因子和启动子片段结合试验,以确定HcCHSA上游转录因子。结果显示转录因子Antp能够与HcCHSA启动子区结合并激活HcCHSA的表达;但转录因子Br-C无法与HcCHSA启动子区域结合。综上,饥饿逆境与保幼激素类似物处理导致美国白蛾幼虫体内能量代谢受到调控,从而影响几丁质生物合成。其次,美国白蛾几丁质合成通路基因HcGFAT与HcCHSA在美国白蛾几丁质合成过程中发挥重要功能。本研究在外源胁迫和分子水平上探究了美国白蛾几丁质合成的调控机理,为开发以几丁质为靶标的害虫防治策略提供了科学的理论依据,同时对促进新型生物农药的开发有一定的实际意义。