【研究背景】登革病毒((Dengue virus,DENV)是一种节肢动物传播的单股正链RNA病毒,可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征。DENV已成为全球健康威胁,世界上约有一半的人口面临感染风险。虽然DENV引起的疾病有一定程度的自限性,但抗体依赖增强(Antibody dependent enhancement,ADE)效应增加了第二次感染异型病毒后的重症率和死亡率。由于没有针对登革病毒的特效治疗药物,因此迫切需要开发安全有效的疫苗来预防感染和疾病进展。目前,只有一种减毒活疫苗(Cy D-TDV)在一些国家获得了临床使用许可,但Cy D-TDV的临床试验表明,其只对既往感染登革热病毒的血清阳性者是有效和安全的。而对第一次接种疫苗的血清阴性者会增加患严重登革热的风险。所以对疫苗的研究和持续开发仍是预防登革病毒感染的有效措施。多肽疫苗可以激发表位特异性抗体和免疫反应,从而消除与疫苗相关的不良反应的风险。同时将多肽疫苗其连接到纳米颗粒上进行递送可以有效的提升免疫原性和代谢稳定性。球形核酸作为一种新兴的纳米材料,可作为多肽或蛋购买Taurine白质输送的载体。在抗病毒研究中,球形核酸不但可以附载相应的抗原表位,而且其表面吸附核酸通常由免疫刺激核酸形成,大大提高了机体的免疫反应。基于球形核酸载体的登革多肽疫苗有望成为预防登革病毒感染的候选疫苗。【研究目的】目前登革疫苗的安全性和有效性在临床上并不令人满意,这就需要一种新的方法来设计更加安全有效的登革疫苗。本研究通过对DENV的四种血清型基因检测,筛选出一组针对登革四种血清型的共有抗原表位,据此设计一种基于球形核酸载体的登革多肽疫苗。以期得到一种具有较好抗原递呈能力、较高安全性及较高免疫效应水平的登革多肽疫苗。【研究方法】(1)多肽疫苗的构建利用紫外分光光度法检测粒径30 nm的Au NP与巯基化的寡核苷酸序列(CSV-1A)是否偶联成功形成球形核酸结构;通过琼脂糖凝胶电泳试验检测含有半胱氨酸的多肽与巯基化的Cp G偶联效果;通过透射电镜,粒径和Zeta电位检测多肽疫苗的形貌、大小及所带电性。(2)骨髓样树突状细胞(BMDCs)最佳培养条件的筛选将BMDCs在含有不同浓度生长因子的培养液中培养,通过免疫荧光试验(immunofluorescence,IF)对BMDCs表面标志物CD11c的表达量进行检测,筛选出最优培养浓度。(3)BMDCs对多肽疫苗的摄取及诱导其成熟的情况通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测BMDCs细胞对多肽抗原的摄取能力进行定性和确认细节定量分析;通过RT-q PCR实验方法在分子水平检测BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况;通过流式细胞术检测BMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的蛋白表达情况;通过酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测BMDCs培养上清中细胞因子IL-12p70的分泌情况。(4)免疫效应及体内安全性评价通过ELISA检测多肽疫苗免疫小鼠后特异性抗体Ig G水平;通过观察各个器官的病理切片检测多肽疫苗在小鼠体内的生物安全性。【研究结果】(1)本研究构建了一种基于球形核酸载体的登革多肽疫苗(SNA-TBB)。该球形核酸递送载体以Au NP为球形核酸的核心,CSV-1A为附着于核心表面的核酸。将含有半胱氨酸的多肽TBB与巯基化的Cp G通过二硫键偶联,CSV-1A与Cp G通过碱基互补配对的方式,将多肽与球形核酸进行偶联。表征分析结果显示,SNA-TBB粒径在50 nm左右,呈表面光滑的球形,并且具有较好的分散性。(2)比较BMDCs在添加不同浓度生长因子培养基中的生长及CD11c的表达情况,筛选出当GM-CSF为10 ng/ml,IL-4为20 ng/ml时,BMDCs的生长情况及CD11c的表达最优;基于球形核酸载体的多肽疫苗对BMDCs不产生细胞毒性,并且能有效地递呈抗原。SNA-TBB在分子水平及蛋白水平均能有效刺激Multiplex ImmunoassaysBMDCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达,也能促进BMDCs分泌IL-12p70。(3)SNA-TBB免疫小鼠后能诱导产生高水平的抗原特异性Ig G抗体,并且通过对免疫后小鼠的心、脾、肺、肾的病例切片观察发现,各脏器未见异常细胞死亡、组织反应或炎症浸润。综上所述,我们构建了一种良好的多肽疫苗递送系统,可有效地促进BMDCs的成熟及活化,诱导产生较高的抗原特异性Ig G抗体,并且具有较好的体内外安全性。【研究意义】本研究成功构建了一种基于球形核酸载体的递送系统,该递送系统可有效地将抗原递呈至BMDCs,刺激BMDCs成熟及活化。有效解决了多肽疫苗免疫原性差的问题,同时表现出良好的生物安全性。多肽疫苗作为一种新兴的第三代疫苗技术,为研究安全有效的登革疫苗提供了新的研究思路及方向。