新型冠状病毒肺炎(Coronavirus diseasebile duct biopsy 2019,COVID-Pevonedistat19)是一种由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒 2(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染导致的急性呼吸系统传染病,疫情在全球范围大流行导致大量感染、重症及死亡病例,造成巨大的公共卫生与经济负担。目前疫情防控面临新挑战。SARS-CoV-2基因组的不断进化与频繁变异产生了多种变异株,目前流行的Omicron变异株已显示出更强的传播力与明显的免疫逃逸性,对现有疫苗的防护效率及治疗药物的诊疗效果、疫情的防控等造成严峻挑战。在防治药物中,病毒进入抑制剂具备预防病毒感染以及早期应用截断疾病向危重症转化的作用,可同时作为预防与治疗药物使用。然而,目前已获批的如Molnupiravir和Paxlovid等临床用药均以抑制病毒复制为靶,尚缺乏病毒入侵抑制剂供临床应用。面对疫情长期共存、病毒频繁变异导致传播力增强的现状以及大量因基础疾病等无法接种疫苗的人群,研发具备预防与治疗COVID-19的广谱病毒入侵抑制剂具有更强的现实意义。疫情暴发后,连花清瘟胶囊作为中医药抗疫代表性治疗药物被纳入《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》批准用于COVID-19的临床治疗。临床研究证实使用连花清瘟胶囊能够提高患者临床治愈率,预防密接与次密接感染;体外研究证实,连花清瘟方能够抑制SARS-CoV-2病毒复制。既往研究明确连花清瘟方对SARS-CoV、H3N2流感病毒、呼吸道合胞病毒等具有广谱抗病毒作用。尽管目前连花清瘟方预防与治疗COVID-19的有效性得到了一定程度的确认,然而其抗SARS-CoV-2及广谱抗病毒的药效物质与作用机制仍有待进一步研究。由于SARS-CoV-2具有高致病性与高传染性,使用完整病毒毒株进行研究需要在生物安全级别(biosafety level,BSL)3级或4级实验室进行。我国高级别生物安全实验室资源紧张,严重限制了 SARS-CoV-2研究,因此,寻找可用于普通生物安全实验室的SARS-CoV-2替代模型十分必要。同时,用于模拟SARS-CoV-2感染的动物或细胞模型与人体存在较大差异,仅能够模拟部分SARS-CoV-2感染特征,也需开发更接近人体真实状况的宿主模型。针对上述问题,课题组已经构建出包含SARS-CoV-2全部结构蛋白的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),因其仅含有病毒结构蛋白不具有复制能力,是一种安全、仿真的病毒替身模型。作为宿主模型,由人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)诱导分化的肺泡球类器官具有最接近真实人体的蛋白表达谱,可弥补目前宿主模型的缺陷,用于SARS-CoV-2感染研究。研究目的明确连花清瘟方原药及大鼠含药血清中含有的中药化学成分;明确连花清瘟方对SARS-CoV-2病毒入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合的影响;筛选连花清瘟方来源的具有抑制SARS-CoV-2病毒入侵宿主细胞的药效成分,并阐明其作用机制。研究方法1.使用连花清瘟方对SD大鼠进行灌胃,获取连花清瘟方含药血清;通过UPLC-MS/MS方法对连花清瘟方原药与大鼠含药血清进行中药化学成分检测;比较连花清瘟方原药与含药血清的中药化学成分,筛选出代谢成分;最后通过文献挖掘方法对连花清瘟方来源中药化学成分抗病毒功效进行归纳整理,筛选候选药物。2.利用病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)与荧光素酶报告基因技术,构建带有荧光素酶标签的SARS-CoV-2 VLPs(Luc-VLPs);以人血管紧张素转换酶 2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)转基因 C57BL/6J 小鼠作为动物模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分预防性灌胃给药后,使用VLPs进行干预,构建SARS-CoV-2感染模型,通过检测肺内Luc-VLPs水平,以及利用免疫荧光染色技术可视化肺内VLPs数量,判断连花清瘟方预防SARS-CoV-2感染效果,并利用免疫印迹法对药物干预后ACE2、跨膜丝氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2,TMPRSS2)表达水平进行检测,判断药物对SARS-CoV-2入侵相关受体的影响。3.以Vero E6细胞作为SARS-CoV-2通过内吞途径入侵的细胞模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分对SARS-CoV-2 VLPs入侵Vero E6细胞过程进行干预,根据入侵细胞内VLPs水平,判断药物对SARS-CoV-2内吞途径进入宿主细胞的影响。4.以二分蛋白法(dual split protein,DSP)构建SARS-CoV-2膜融合途径入侵的细胞模型,使用连花清瘟方及其来源的中药化学成分对SARS-CoV-2膜融合过程进行干预,根据膜融合后形成的绿色荧光蛋白及荧光素酶水平判断药物对SARS-CoV-2膜融合途径入侵宿主细胞的影响。进一步利用DSP法构建SARS-CoV-2突变株及其它冠状病毒SARS-CoV与MERS-CoV膜融合细胞模型,判断连花清瘟方来源化学成分的广谱膜融合抑制效果。5.利用人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cells,hiPSC)诱导分化人Ⅱ型肺泡样上皮细胞(alveolar epithelial cells type Ⅱ,AECⅡ),并通过3D培养构建AECⅡ肺泡球模型;利用免疫荧光染色技术检测AECⅡ表达病毒入侵相关受体ACE2以及TMPRSS2水平;利用与人体蛋白表达谱十分相近的AECⅡ肺泡球作为宿主模型,使用筛选所得连花清瘟方来源有效中药化学成分对SARS-CoV-2 VLPs入侵AECⅡ进行干预,进一步判断药物对SARS-CoV-2病毒颗粒入侵宿主细胞的影响。6.对具有抑制SARS-CoV-2膜融合功效的连花清瘟方来源中药化学成分(山奈酚)的作用机制做进一步研究,通过检测药物对膜融合不同阶段的影响,判断药物作用靶点。首先,检测药物对SARS-CoV-2 S蛋白受体结合域(spike protein receptor-binding domain,S-RBD)与宿主细胞受体 ACE2 结合过程的影响。使用药物对S-RBD与表达ACE2的HEK-293F细胞的结合过程进行干预,利用流式细胞术检测与ACE2结合的S-RBD水平判断药物对S-RBD与ACE2结合的影响。进一步,检测药物对宿主TMPRSS2对S蛋白S2亚基切割过程的影响。利用瞬时转染技术构建表达TMPRSS2的HEK-293T细胞,使用药物对该细胞对TMPRSS2荧光底物Boc-QAR-AMC的切割过程进行干预,根据荧光信号判断药物对TMPselleck激酶抑制剂RSS2酶切活性的影响;利用瞬时转染技术分别构建表达TMPRSS2的HEK-293F-ACE2细胞与表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK-293T细胞,将两细胞混合,模拟TMPRSS2对S蛋白切割过程,使用药物对这一过程进行干预,利用蛋白免疫印迹法检测切割后产物,判断药物对TMPRSS2对S蛋白酶切过程的影响;通过分子对接技术预测药物与TMPRSS2的亲和力及结合位点;利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术对山奈酚与S蛋白不同亚基的结合亲和力进行检测;利用细胞热位移技术,使用药物对表达SARS-CoV-2 S蛋白的HEK-293T细胞进行干预,使用蛋白免疫印迹法检测经过不同温度处理后细胞表达的S蛋白含量,判断药物是否具有与S蛋白结合能力。最后,检测药物对S2亚基上负责完成膜融合的七肽重复序列1与2(heptad repeat 1/2,HR1/2)形成 6-螺旋束(six-helix bundle,6-HB)的影响。利用圆二色谱技术,检测药物对HR1与HR2的二级结构以及形成6-HB过程的影响;利用非变性凝胶电泳技术及氨基酸突变技术,检测药物对预测作用靶点氨基酸突变前后HR1、HR2以及形成6-HB过程的影响;利用原子力显微镜,在气相观测条件下检测药物对HR1、HR2以及6-HB结构稳定性的影响。研究结果1.从连花清瘟方原药与大鼠含药血清中共检测出129种中药化学成分,其中9种成分仅在大鼠含药血清中检出,为原药代谢产物;经过文献挖掘,38种连花清瘟方来源的中药化学成分对34种巴尔的摩病毒分类法Ⅰ至Ⅵ类不同病毒有明确文献报道的抗病毒功效,其抗病毒作用机制包括抑制病毒黏附、进入、复制、合成、释放以及直接破坏病毒结构等。2.连花清瘟方预防性给药动物实验结果显示,模型组小鼠肺内VLPs水平升高至背景组的2330±399%(p<0.005),阳性对照药物熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)组肺内 VLPs 水平降低至 232±72%(p<0.005),连花清瘟方组肺内VLPs水平降低至267±101.8%(p<0.005);免疫荧光染色结果显示,模型组小鼠肺组织细胞内可见大量VLPs颗粒,连花清瘟方与阳性对照药物UDCA干预组肺组织细胞内VLPs数量显著降低;免疫印迹实验结果显示UDCA干预降低了小鼠肺ACE2表达水平,而连花清瘟方干预不影响ACE2表达水平。上述结果提示连花清瘟方具有预防SARS-CoV-2感染功效,并且其预防感染效果不通过改变宿主ACE2发挥作用。3.连花清瘟方原药与含药血清对SARS-CoV-2入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合均具有抑制作用;从连花清瘟方含有的129种中药化学成分中,结合文献对药物抗病毒功效的报道,筛选出芦荟大黄素、大黄酸、连翘酯苷A、连翘酯苷Ⅰ、连翘苷、野黑樱苷、红景天苷、广藿香酮、山奈酚、芦丁、地奥司明、香叶木素、木犀草素、新绿原酸、甘草酸、α-亚麻酸、绵马贯众素ABBA共17种中药化学成分进行后续研究;结果显示,这17种药物对SARS-CoV-2病毒颗粒内吞途径入侵宿主细胞均无抑制作用;其中山奈酚对SARS-CoV-2 S蛋白、ACE2与TMPRSS2共同介导的膜融合过程具有明显抑制作用。4.连花清瘟方来源中药化学成分(山奈酚)预防性给药动物实验结果显示,模型组小鼠肺内VLPs水平升高至背景组的2480±220%(p<0.005),山奈酚组肺内VLPs水平降低至1944±103%(p<0.005);免疫荧光染色结果显示,模型组小鼠肺组织细胞内可见大量VLPs颗粒,山奈酚干预组肺组织细胞内VLPs数量显著降低;蛋白免疫印迹实验结果显示山奈酚干预不影响小鼠ACE2表达水平。上述结果提示山奈酚具有预防SARS-CoV-2感染功效,并且其预防感染效果不通过改变宿主ACE2发挥作用。进一步以与人体蛋白表达谱十分接近的AECⅡ作为宿主模型的体外细胞实验证实,山奈酚干预组细胞内VLPs水平较模型组降低了 46.3±15.8%(p<0.005),山奈酚具有整体抑制SARS-CoV-2病毒颗粒入侵AECⅡ的功效。5.山奈酚不影响SARS-CoV-2 VLPs通过内吞途径入侵Vero E6细胞;在SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2介导的膜融合过程中,山奈酚仅对同时存在TMPRSS2的膜融合过程具有抑制作用(p<0.005);山奈酚同时对SARS-CoV-2 Delta、Omicron 突变株(BA.1、BA.2、BQ.1.1、XBB.1)以及 SARS-CoV、MERS-CoV具有广谱膜融合抑制作用。随后的机制研究证实,山奈酚不影响SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2的结合,但对TMPRSS2酶活性具有一定的抑制作用(p<0.005)。分子对接结果证实山奈酚能够与TMPRSS2酶活性位点Ser 441结合。SPR以及细胞热位移实验发现,山奈酚与S蛋白,特别是S2亚基存在相互作用。对山奈酚对S2亚基中驱动膜融合的HR的作用研究中发现,在圆二色谱检测中,山奈酚抑制HR1与HR2形成6-HB,并对HR1二级结构中的α-螺旋构象具有破坏作用;在非变性凝胶电泳检测以及原子力显微镜观测中发现,山奈酚能够破坏HR1与HR2结构稳定性,抑制6-HB的形成;氨基酸突变结果显示,赖氨酸残基对于HR1结构稳定性具有正向调节作用,对HR2结构稳定性具有负向调节作用;山奈酚对赖氨酸突变的HR丧失了破坏作用提示山奈酚的作用靶点是HR中的赖氨酸残基。研究结论1.利用带有荧光素酶标签的复制缺陷型SARS-CoV-2 Luc-VLPs结合人ACE2转基因小鼠动物模型和AECⅡ模型能够在一定程度上复现SARS-CoV-2病毒颗粒入侵宿主细胞的生物学过程,可用于研究药物对病毒颗粒入侵宿主阶段的影响。2.连花清瘟方对SARS-CoV-2入侵宿主细胞的两种途径,内吞与膜融合均具有抑制效果,连花清瘟方来源的中药化学成分——山奈酚具有广谱膜融合抑制功效,两药物作为SARS-CoV-2病毒进入抑制剂均具有预防SARS-CoV-2感染的功效。3.山奈酚抑制膜融合作用机制为靶向S2亚基HR区赖氨酸残基,破坏HR结构稳定性,抑制6-HB形成。发现赖氨酸残基对HR结构稳定性的影响为进一步深入认识冠状病毒HR结构以及基于山奈酚作为先导化合物开发靶向HR的广谱膜融合抑制剂提供实验研究基础。