家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)感染引发的微粒子病是对养蚕业最具威胁性的病害之一。因此,针对微粒子病研发安全有效的特异性防治药物及其分子靶点的相关研究具有重要的实践意义。海藻糖酶(trehalase)作为一种糖苷酶,可催化一分子海藻糖水Baricitinib价格解为两分子葡萄糖,在生物体的生命活动,例如孢子发芽、昆虫飞行、抗逆等活动中发挥重要的作用。序列分析发现,家蚕微孢子虫基因组中存在四个海藻糖酶基因,但其在微孢子虫感染以及发育过程中的功能尚未明确。本研究通过real-time PCR、免疫荧光、RNA干扰及His pull-down等技术对感染宿主后家蚕微孢子虫海藻糖酶(基因)的表达模式、亚细胞定位及其功能等特性进行了分析和研究,旨在揭示海藻糖酶在家蚕微孢子虫感染及发育过程中的功能,为家蚕微粒子病新型防治药物的研发提供理论参考。本研究的主要实验结果如下:1.家蚕微孢子虫海藻糖酶(Nosemahttps://www.selleck.cn/products/lxh254.html bombycis trehalase,Nb Tre)基因表达谱分析利用real-time PCR技术对4个Nb Tre基因在家蚕微孢子虫感染后不同时间的转录水平进行了检测。结果显示它们在感染不同时间均有不同程度的表达。Nb Tre1和Nb Tre3基因在微孢子虫感染后的6小时转录水平最高,从感染12小时开始其转录水平大幅下降,到感染14Cardiac biomarkers4小时,Nb Tre1、Nb Tre2和Nb Tre3基因都有一定水平的转录,其中Nb Tre2转录水平较高。Nb Tre4基因在微孢子虫感染后2小时转录水平最高,随后转录水平逐渐降低,在感染48小时后其转录水平几乎为零。此外,Nb Tre2基因在微孢子虫感染后2小时转录水平几乎为零,在感染后6小时转录水平最高,推测其在家蚕微孢子虫休眠孢子发芽前没有被激活转录,从孢子发芽开始(后)才被激活转录,发挥其功能。2.Nb Tre亚细胞定位分析利用免疫荧光技术对4个Nb Tre在感染微孢子虫的家蚕培养细胞Bm N中的分布进行了检测。结果发现在在家蚕微孢子虫感染细胞后的整个发育过程中,Nb Tre1主要定位在孢原质中,宿主细胞中几乎没有检测到;Nb Tre2在家蚕微孢子虫感染细胞后的发育过程中,主要定位在孢原质膜或孢子壁上,同时宿主细胞中发现有大量绿色荧光;Nb Tre3在家蚕微孢子虫感染细胞后的增殖期,主要定位在孢原质中,宿主细胞中发现有微弱的绿色荧光,而在孢子形成期,孢子中的荧光变弱,宿主细胞尤其是其细胞核或核膜中观察到有明显的绿色荧光;Nb Tre4在家蚕微孢子虫感染细胞后的发育过程中,主要定位在孢原质膜或孢子壁上,以及宿主细胞的细胞核或核膜上也观察到了绿色荧光。利用免疫荧光技术对家蚕微孢子虫休眠孢子中的4个Nb Tre的分布分别进行了检测。结果发现,Nb Tre1的荧光信号最强,主要定位在孢原质膜或孢子壁上;而在家蚕微孢子虫休眠孢子中没有检测到Nb Tre2的荧光信号;Nb Tre3在家蚕微孢子虫成休眠孢子中显示出微弱的绿色荧光,主要分布于孢原质膜或孢子壁上,孢原质中只有极其微弱的荧光;Nb Tre4在家蚕微孢子虫休眠孢子中的荧光标记信号也较弱,主要分布于孢原质膜或孢子壁上。3.沉默Nb Tre基因表达对家蚕微孢子虫的影响利用RNAi技术对Nb Tre基因进行沉默表达。结果显示,分别单独抑制Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3或Nb Tre4基因的表达,对家蚕微孢子虫16S r RNA的转录水平都有很大的影响,其中Nb Tre1的沉默表达对Nb16S r RNA转录水平的影响最大,相比对照组转录水平显著下降。而同时对Nb Tre1和Nb Tre3基因沉默表达或同时对Nb Tre2和Nb Tre4基因沉默表达并没有比单独抑制某个Nb Tre基因的效果更显著。但是当同时沉默表达Nb Tre1、Nb Tre2、Nb Tre3和Nb Tre4四个海藻糖酶基因时,Nb16S r RNA的转录水平极显著下降。4.海藻糖酶抑制剂处理对家蚕微孢子虫及其宿主的影响用海藻糖酶抑制剂井冈霉素A处理微孢子虫感染的家蚕细胞后,通过real-time PCR检测Nb16S r RNA转录水平发现其与对照组相比转录水平显著降低。通过对酶活检测、糖原、细胞毒性和几丁质浓度检测发现,抑制剂能抑制海藻糖水解酶的活性,使糖原含量明显降低,同时影响几丁质的合成途径,从而降低了微孢子虫中几丁质的含量,但其在干扰微孢子虫生命活动的同时对于宿主细胞不产生毒害影响,是家蚕微粒子病稳定有效的一种防治策略。5.Nb Tre3互作蛋白的鉴定通过分子克隆、原核表达及蛋白纯化获得了Nb Tre3全长氨基酸重组蛋白,利用His pull-down和LC-MS/MS质谱技术对与Nb Tre3互作的蛋白进行了鉴定分析。结果共鉴定出28种蛋白。因Nb Tre3氨基酸序列与其它三个Nb Tre,之间的序列相似性均超过85%,因此一定程度上Nb Tre3的互作蛋白可能也是Nb Tre1、Nb Tre2和Nb Tre4的互作蛋白。这些互作蛋白大部分来源于宿主家蚕,推测家蚕微孢子虫感染宿主后可能通过分泌部分海藻糖酶到宿主细胞中,从而利用宿主细胞的营养物质完成自身的生命周期。