覆盆子酮(Raspberry ketone,RK)是覆盆子果实的主要香味物质,广泛应用于香水化妆品和食品添加剂行业中。目前RK主要由化学法生产,由于微生物发酵合成RK的产量低,通过酶/全细胞催化合成RK备受关注。本实验室前期实现了利用大肠杆菌工程菌(YB-9)全细胞催化对羟基亚苄基丙酮(4-HBA)合成RK,本文在此基础上,以对羟基苯甲醛(4-HBD)为起始底物,探究一锅级联和分步级联合成RK的方法。具体研究内容如下:(1)以4-HBD和丙酮为底物一锅级联合成RK。考察YB-9利用其内源脱氧核糖核酸醛缩酶(DERAEc)催化4-HBD和丙酮合成中间产物4-HBA继而利用YB-9的NADPH再生还原为RK,发现YB-9能少量合成4-HBA但不产生RK。建立甲基叔丁基醚(MTBE)和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(SCB)组成的两相催化体系并确定体积分数;构建过表达DERAEc的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pRSF-deoc(Z-1),并和YB-9进行双菌一锅催化4-HBD合成RK,结果以32 mmol·L-1 4-HBD和320 mmol·L-1丙酮为底物催化 24 h 可得到 0.11 mmol·L-1 RK。(2)以4-HBD和异丙醇为底物一锅级联合成RK。构建共表达短乳杆菌来源异丙醇脱氢酶和覆盆子酮合成酶的工程大肠杆菌,以异丙醇为底物提供丙酮并再生NADPH。结果以32 mmol·L-1 4-HBD和5%异丙醇为底物反应可合成0.04 mmol·L-1 4-HBA,但未检测到RK生成,分析发现RK能被异丙醇脱氢酶转化为另一种产物。(3)优化4-HBD和丙酮合成4-HBA的参数。考察4-HBD级联催化合成RK第一步反应的参数,结果在菌体Z-1用量4%(w/v)、4-HBD浓度120 mmol·L-1、丙酮含量80%、反应温度60℃、反应时间48 h条件下,4-HBA的浓度达到111.36 mmol·L-1,产率92.80%。利用卡拉胶固定化制备固定化细胞,以120 mmol·L-1 4-HBD为底物每批次反应36h,重复10批次持续催化,4-HBD的摩尔转化率保持在90%以上,4-HBA平均浓度60.69 mmol·L-1。进一步,通过柔性位点刚化的策略理性改造野生型DERAEc的机溶剂稳定性,获得突变株DERAEc(S238D),其在60℃和80%的丙酮中保温4 h,酶活剩余58.04%,是野生型剩余酶活的3.24倍。(4)优化4-HBA到RK的合成。构建过表达异柠檬酸脱氢酶的E.coli BL21(DE3)/pRSF-ecidh-rirzsl(Z-4),通过偶联 NADPH 再生,在 0.1 mol·L-1 pH 5.5 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,61 mmol·L-1 4-HBA最高合成51.02 mmol·L-1 RK,产Trichostatin A化学结构率为83.63%。(5)双菌分步级联催化4-HBD合成RK,第一步反应条件为:全细胞Z-1/DERAEc(S238D)含量4%(w/v)催化120 mmol·L-folding intermediate1 4-HBD在selleck丙酮中于60℃反应36 h;第二步,将第一步的反应液去除细胞并回收丙酮后,加入柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和4%(w/v)Z-4催化2 h最高得到50.00 mmol·L-1 RK,由4-HBD到RK的产率为83.33%。