动物的免疫包括先天性免疫和适应性免疫。在适应性免疫中,T淋巴细胞主要依赖其表面高度多变的T细胞受体(T cell receptor,TCR)识别抗原,产生细胞特异性免疫应答。根据TCR的不同主要可分为两类T细胞:表达α和β链的αβT细胞以及表达γ和δ链的γδT细胞。γδT细胞能仅依赖TCR异二聚体识别非MHC(major histocompatibility complex)递呈的抗原信息,在迅速活化后参与机体的早期免疫,是连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。人类和小鼠的γδT细胞主要依据γδTCR使用的Vδ或Vγ进行亚群分类。不同的γδT细胞亚群在胸腺中发育成熟的时间不同,定植的外周器官(组织)不同,行使的免疫学功能也不同。鸡具有“高比例”的γδT细胞,γδT细胞参与机体抵抗病原入侵的免疫应答。与人类和小鼠类似,鸡γδT细胞同样分批次发育。目前,鸡TCR基因的详细结构、γδT细胞的亚群分类以及γδTCR的多样性特征尚不清楚。分析鸡T细胞受体的基因组结构及表达特征,对于深入了解鸡对病原微生物的免疫应答机制,培育抗病力强的鸡具有重要的意义。本研究首先获得了鸡TCR基因座位的完整胚系结构,然后利用5′RACE结合高通量测序的方法解析了鸡个体发育早期三个主要淋巴器官胸腺、脾脏和肠道组织的TCRγ和TCRδ表达组库的动态变化特征。主要结果如下:1.鸡TCR基因结构特征(1)红原鸡TCRβ基因座位长约210 kb,呈现易位子结构。16个Vβ基因片段排列在该座位的5′区域,可分为3个家族。其中,Vβ3家族是本研究新发现的Vβ家族,仅包含1个有功能的Vβ基因片段。相较哺乳动物,鸡的Vβ与爬行类的Vβ进化关系更近。在该基因座位中,V片段串联排列区域由Vβ1-PRSS1(protease serine 1,PRSS 1)和Vβ2-PRSS2分别经9次和3次重复构成。鸡胸腺中TCRβ的重排偏向于使用D基因片段、Vβ1家族和Jβ1基因片段,新发现的Vβ3.1基因片段同样参与重排和表达。(2)红原鸡TCRγ基因座位长约100 kb,同样呈现易位子结构。该座位共包含44个Vγ基因片段,可分为6个家族。Vγ1～Vγ3家族同前人的研究对应,新发现的三个家族中仅Vγ4包含有功能的Vγ基因片段。Dot-plot分析发现,各Vγ家族的基因片段按照一定的顺序串联排列,构成保守的重复单元。主要的重复单元包含9或10个Vγ,经四次重复形成了该基因座位的5′区域。鸡中所有的Vγ与爬行类的Vγ进化关系更近,与哺乳动物的Vγ进化关系较远。(3)红原鸡TCRα/δ座位长约950 kb,呈现易位子结构。该基因座位上游存在120个V基因片段。其中,73个Vα基因片段selleck化学和47个Vδ基因片段各分为3个家族。Vα3、Vδ2和Vδ3家族是本研究新发现的V基因片段家族,分别包含1、2和1个具有潜在功能的V基因片段。系统发生分析发现,鸡的Vα3和Vδ2仅与鸟类和爬行类的V基因片段聚类,而Vα1、Vα2、Vδ1和Vδ3还与哺乳类的V基因片段有较近的进化关系。与牛和羊等“γδ-high”物种中的数目类似,鸡的TCRα/δ包含数目更多的Vδ基因片段。2.鸡个体发育早期胸腺、脾脏和肠道中的TCRγ和TCRδ组库动态变化特征在鸡个体发育的早期,γδT细胞在胸腺中分三个批次发育成熟并迁移至外周淋巴器官(组织)。本研究在前两次γδT细胞迁移波定植脾脏和肠道组织的初期采集白来航鸡胸腺、脾脏和肠道组织样本,并利用5′RACE和高通量测序的方法,分析两次细胞迁移波间以及三个组织间TCRγ和TCRδ组库特征。(1)TCRγ和TCRδ的克隆型多样性分析。反映克隆型多样性的香农指数和空间内稳态分析表明,鸡胸腺TCRγ和TCRMetal bioavailabilityδ的克隆型多样性高于脾脏和肠道,TCRδ的克隆型多样性高于TCRγ。共有克隆型(三个生物学重复共有的克隆型)分析发现,TCRγ和TCRδ的共有克隆型在同一次细胞波的三个组织间或者同一组织的两次细胞波间均不相同。三个组织特异表达的共有克隆型随个体发育增加。(2)TCRγ和TCRδ组库的V-(D)-J组合多样性分析。全部有功能的Vγ和Jγ基因片段均参与TCRγ的重排。除2个Vδ1基因片段外,全部有功能的Vα、Vδ、Dδ和Jδ基因片段均参与TCRδ的重排。与第一次细胞波相比,第二次细胞波显著增加了Vγ2家族尤其是Vγ2.2/2.9p/2.13基因片段以及Jδ1的使用。但各V-J组合的使用频率在同一细胞波的三个组织间以及同一组织的两次细胞波间均相似。以上结果显示,外周淋巴组织的组合多样性特征与同时间胸腺的相似。结果说明鸡的γδT细胞不存在按照可变区的基因片段使用进行亚群分类、不同亚群定植不同外周淋巴组织的特征。此外,鸡中也存在VHδ参与TCRδ重组的现象。(3)CDR3γ和CDR3δ的序列特征分析。CDR3γ和CDR3δ中各氨基酸的使用频率在各组织和时间点中无显著差异。CDR3γ和CDR3δ的长度跨度高度相似,99%以上的CDR3γ长度范围为5～19 AA,平均长度为12 AA。99%以上的CDR3δ长度范围为5～21AA,平均长度为12.6 AA。(4)外周器官(组织)的高表达TCR序列特征分析。对肠道中高表达序列分析发现,第二次细胞波中明显增加了Vγ2.2/2.9p/2.13基因片段、Vγ2.4/2.7p/2.11p/2.15-Jγ2组合并且CDR3γ长度为11-AA的TCRγhttps://www.selleck.cn/products/mln-4924.html的使用频率。对脾脏中高表达序列分析发现,两次细胞波中均高比例的使用Vγ4-Jγ2组合并且CDR3γ长度为9-AA的TCRγ。综上所述,本研究首次发现,鸡γδT细胞不存在按可变区序列分亚群、不同亚群发育时间及定植组织不同的特征;γδT细胞从胸腺迁入外周后,TCRγ及TCRδ组库的组合多样性并无显著的改变;胸腺中的克隆型多样性高于脾脏和肠道组织,增加的更多是连接多样性。研究结果为阐明鸡γδT细胞的发育和定植规律,揭示γδT细胞在家禽免疫应答中的生物学功能提供理论依据。