阿萨希毛孢子菌(Trichosporon asahii)在人或动物免疫力低下时引起严重的深部感染甚至死亡,并对大多数临床抗真菌药物表现耐药。研究发现磷脂酶活性强的菌株,耐药现象更严重。另外,磷脂酶属于脂质代谢通路相关基因,而脂质与耐药性存在关联。真菌的生物学研究已经进入了功能基因组时代,基因的功能解析研究能为阿萨希毛孢子菌的治疗提供理论依据。根据本课题组前期转录组数据分析可知基因磷脂酶A2(PLA2)在耐药株中变化显著,且阿萨希毛孢子菌氟康唑诱导耐药株的磷脂酶活性增强。因此,本研究以阿萨希毛孢子菌PLA2(TaPLA2)为研究对象,旨在探究其过表达对阿萨希毛孢子菌生长的影响以及在耐药过程中发挥的作用,为进一步研究阿萨希毛孢子菌耐药机制及新药研发提供参考。试验一TaPLA2克隆及生物信息学分析。以阿萨希毛孢子菌野生株YAN0802基因组为模板进行TaPLA2克隆,得到目的片段,经比对TaEtoposide溶解度PLA2长435bp,与NCBI上发布的T.asahii临床标准株CBS2479的基因序列一致。蛋白预测结果显示TaPLA2是小分子量蛋白质,含144个氨基酸ABT-199体内实验剂量,保守结构域为pfam09056,属于Phospholip＿A2＿3超家族,在氨基酸序列N端含有一个信号肽,且不存在跨膜结构域,具有典型的Ca~(2+)结合位点和HD催化位点,预测结果表明TaPLA2结构特点符合分泌型磷脂酶A2特征。系统发育树发现其与白僵菌BBA＿07804和蛹虫草CCM＿07919亲缘关系较近,置信度为98%。试验二TaPLA2过表达体系构建。本试验以p EGFP-N1为基础载体,利用同源重组构建过表达载体,转化大肠杆菌DH5α感受态,挑取单克隆进行PCR扩增、双酶切及测序比对验证,得到过表达载体p EGFP-N1-TaPLA2。通过根癌农杆菌转化法将过表达载体转入野生株YAN0802,以200μg/m L的G418为筛选浓度,挑取转化子验证。通过PCR扩增荧光标签、荧光定量PCR验证和绿色荧光观察鉴定出阳性转化子并扩大培养,成功构建过表达突变株TaPLA2~(OE)。试验三TaPLA2~(OE)生物学特性及耐药性分析。本试验通过蛋黄培养基测定发现TaPLA2~(OE)磷脂酶活性呈强阳性。通过测量菌落直径和铜环培养法观察生物学特性,结果显示TaPLA2~(OE)生长减慢,菌落较野生株小、中间隆起、边缘不整齐、菌落表面无粉末状覆盖,在培养3d后显微镜观察到菌丝减少孢子增多,第三天大量关节孢子与菌丝共存。微量肉汤稀释法和琼脂斑点法测定耐药性发现TaPLA2~(OE)对氟康唑、伏立康唑、两性霉素B和5-氟胞嘧啶均表现出耐药。其中,XTT减低法得出TaPLA2~(OE)生物膜活性强,RT-q PCR检测发现TaPLA2~(OE)耐药基因均上调表达。TaPLA2~(OE)对Al~(3+)/Cu~(2+)氧化胁迫不敏感、对温度胁迫不敏感,但对SDS/CR细胞壁胁迫敏感,RT-q PCR检测发现几丁质合成或降解基因下调表达、细胞壁完整性相关基因ALS、GPI也下调表达,但细胞壁完整性信号通路之一HOG-MAPK通路基因上调表达以维持细胞存活。结论:TaPLA2长435bp,生物信息学分析预测其属于s PLA2家族。通过同源重组和根癌农杆菌转化法成功构建过structured medication review表达突变株TaPLA2~(OE)。TaPLA2~(OE)耐药性增强,外排泵基因表达上调和生物膜形成增加;对细胞壁抑制剂敏感,几丁质合成减慢的同时激活HOG-MAPK信号通路以维持细胞壁完整性,且HOG1、MAPK上调表达增强唑类耐药性。