风湿病是一组侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病,其中多数为自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID),包括类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)、干燥综合征(Sj?gren’s syndrome,SS)、特发性炎症性肌病(Idiopathic inflammatory myopathies,IIM)等,发病多隐蔽,病程较长。虽然风湿病的确切发病机制尚不清楚,但目前认为是由于在特定遗传背景上,受到环境及感染等相关因素诱导,而引发的涉及先天性免疫、适应性免疫及非免疫因素共同LGX818说明书参与的免疫功能紊乱,最终导致多器官受损,目前诊断及治疗均有一定难度。近年来,氧化损伤介导的免疫功能失调、细胞死亡信号异常激活以及自身抗体产生在风湿病发病中的作用逐渐得到重视。细胞代谢过程中在线粒体产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)可以导致DNA、蛋白质及脂质的损伤。线粒体是细胞的动力工厂,是细胞进行有氧呼吸的主要场所,由于线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)处在ROS等自由基的包围中,缺乏组蛋白保护,其内部缺乏完整的修复系统,因此与核内基因组相比,mtDNA极易发生突变,在风湿病、退行性疾病及肿瘤当中,可见mtDNA具有广泛的变异。线粒体D-环(D-loop)区是mtDNA的非编码区,由三个高变区(hypervariable regions,HV-I,HV-II,HV-III)组成,mtDNA突变主要集中在这个区域,此区域的突变会引起整个线粒体功能的紊乱影响呼吸链功能,改变机体的免疫状态。MtDNA拷贝数受到严格调控,以确保线粒体能够产生适量的能量和细胞内信号,维持细胞正常功能。MtDNA拷贝数反映了未知遗传因素和氧化应激之间的基因-环境交互作用,已被证明是一个有潜力的疾病风险预测因子。本课题深入研究mtDNA的D-loop区单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)及拷贝数与风湿病的关系,测定ROS及细胞因子水平,探究风湿病发病中“遗传-免疫-非免疫”因素间相互关系,揭示mtDNA在风湿病发生中的潜在作用,筛选与风湿病发生相关的标志物,鉴定影响疾病的细胞因子,为风湿病的精准诊疗包括早期诊断及生物靶向治疗提供依据。第一部分:线粒体基因组D-loop区单核苷酸多态性及拷贝数与多发性肌炎及皮肌炎发病风险关系的研究目的:氧化损伤诱导的线粒体功能障碍可能通过激活肌肉分解代谢和自噬途径启动IIM的Gender medicine肌肉损伤。本研究测定mtDNA的D-loop区SNPs和mtDNA拷贝数,并旨在评估它们与多发性肌炎(polymyositis,PM)和皮肌炎(dermatomyositis,DM)发病风险的关系。方法:本研究纳入PM/DM患者86例及健康对照组110例,从外周血中提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增mtDNA的D-loop区目的片段,对产物进行测序;高灵敏度活性氧检测套件测定血清ROS水平;流式免疫荧光微球技术检测细胞因子水平;进行实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析,以测量mtDNA的相对拷贝数。结果:1.PM/DM患者的SNPs的平均频率明显高于对照组(8.779±1.912 vs.7.972±1.903,P=0.004),在DM患者中D-loop区呈现出高SNPs突变频率(8.803±1.890 vs.7.792±1.903,P=0.004)。2.在PM/DM中发现2个多态性变异位点(16304T/C、16519T/C)与其的发病风险有关,线粒体D-loop区中的16304C(P=0.047)和16519C(P=0.043)基因型与PM/DM发病风险可能有关。3.PM/DM风险相关16519C基因型与抗核抗体(antinuclear antibody,ANA)阳性状态相关(C:90.48%vs.T:68.18%,P=0.011)。4.PM/DM患者的ROS水平明显高于对照组(18477.756±13574.916 vs.14484.191±5703.097,P=0.012)。5.PM/DM风险相关16304C基因型与白介素-4(interleukin-4,IL-4)低表达显著相关(P=0.021),而16519C基因型与白介素-2(interleukin-2,IL-2)高表达有相关性趋势(P=0.064)。6.PM/DM患者中的mtDNA拷贝数显著高于对照组(0.602±0.457 vs.0.300±0.118,P<0.001),亚组分析中,PM患者(0.876±0.652 vs.0.300±0.118,R428使用方法P=0.021)及DM患者(0.566±0.417 vs.0.300±0.118,P<0.001)较对照组分别也观察到了mtDNA拷贝数的升高。小结:MtDNA的D-loop区SNPs可能是PM/DM风险的潜在生物标志物,这些与细胞因子表达相关的SNPs可能参与PM/DM的发生,针对相关细胞因子治疗有望成为潜在的治疗靶点。另外,mtDNA拷贝数介导的线粒体功能障碍可能早于PM/DM发病。第二部分:线粒体基因组D-loop区单核苷酸多态性及拷贝数与女性干燥综合征发病风险关系的研究目的:线粒体功能障碍可诱导固有免疫反应,释放细胞因子,导致SS发病。本研究旨在评估女性SS患者mtDNA的D-loop区SNPs和mtDNA拷贝数与女性SS的相关性。方法:纳入女性SS患者89例及健康对照组98例,从外周血中提取基因组DNA,采用PCR技术扩增mtDNA的D-loop区目的片段,对产物进行测序;高灵敏度活性氧检测套件测定血清ROS水平;流式免疫荧光微球技术检测细胞因子水平;进行q RT-PCR分析,以测量mtDNA的相对拷贝数。结果:1.SS患者的SNPs的平均频率明显高于对照组(8.955±2.028 vs.7.898±1.987,P<0.001)。2.共发现4个多态性变异位点(152T/C,16304T/C,16311T/C,16362T/C)与SS的发病风险有关,152C(P=0.040),16304C(P=0.045),16311C(P=0.045)和16362C(P=0.028)基因型可能增加了SS的发病风险。3.SS发病风险相关16311C基因型与较高的IL-2水平显著相关(P=0.010),而152C基因型与白介素-10(interleukin-10,IL-10)低表达有临界相关性(P=0.058)。4.SS中的mtDNA拷贝数显著高于对照组(1.509±0.836 vs.1.221±0.506,P=0.006)。小结:MtDNA的D-loop区SNPs是SS发病风险的预测因子,可能通过调节细胞因子的表达来改变SS的发生发展,因此,针对相关细胞因子治疗有望成为潜在的治疗靶点。SS患者mtDNA拷贝数升高可能是导致唾液腺细胞损伤原因之一。第三部分:女性系统性红斑狼疮线粒体D-loop区风险相关单核苷酸多态性与活性氧水平关系的研究目的:前期研究发现mtDNA的D-loop区SNPs与SLE发病风险增加相关。本研究旨在探讨D-loop区中SLE风险相关SNPs与氧化应激状态的相关性。方法:选取81名女性SLE患者及102名年龄匹配的的女性对照组纳入研究,应用高灵敏度活性氧检测套件测定血浆ROS水平。结果:SLE患者的血浆ROS水平明显高于对照组(655.025±49.748 vs.533.284±30.033,P=0.030),SLE发病风险相关基因型192T与ROS高表达显著相关(P=0.048)。小结:SLE风险相关的D-loop区的SNPs可能通过增加氧化应激水平引起SLE。抗氧化治疗可能是SLE治疗的潜在治疗手段。