目前,肿瘤仍然是威胁人民生命和健康的主要疾病。传统的肿瘤治疗手段会不同程度地伤害患者的身体健康,毒副作用较大。近年来一些新型的治疗方式,如靶向治疗、免疫治疗、激素疗法以及干细胞移植等等,在临床上的应用发展迅速,但这些治疗方法也存在一定的局限性。例如:细胞因子治疗,具有严重的剂量限制性毒副作用以及不良的代谢动力学特征从而限制了其在临床上的应用;PD-1(programmed cell death protein-1)/PD-L1(programmed cell death-ligand 1)免疫疗法,存在大多数患者对当前的免疫检查点封锁治疗没有响应,表现出原发性耐药,以及部分最开始对治疗有响应的患者最终出现复发,形成获得性耐药的现象。因此,解决以上问题对于肿瘤患者的临床治疗有着非常重大的意义。现有课题组前期研究获得的可特异性结合PD-1并融合细胞因子IL-15(interleukin-15)/IL-15Rα(IL-15receptorα)复合物的异源二聚体融合蛋白分子IAP。从分子结构上来说,其PD-1端可与T细胞表面的PD-1结合,阻断PD-1/PD-L1抑制信号通路解除肿瘤微环境中的免疫抑制,IL-15/IL-15Rα复合物则可以结合T细胞和NK细胞表面IL-2Rβ(interleukin-2 receptorβ),促进T细胞和NK细胞的增殖和活化。但IAP的抗原结合片段(fragment antigen binding,Fab)和可结晶片段(fragment crystallizable,Fc)在体外与蛋白、细胞的结合能力,对T细胞和NK细胞的作用以及体内的抗肿瘤效果如何,仍需进行确证。因此,本研究使用不同种属来源的PD-1和IL-2Rβ蛋白,不同类型的Fc受体以及过表达PD-1的工程化细胞,探索IAP的Fab和Fc段在蛋白和细胞水平上的结合能力,抗体和补体依赖的细胞毒性作用以及对PD-1/PD-L1信号通路的阻断作用;并应用人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),探究IAP对人PBMC中各亚群细胞的结合、增殖和激活能力;同时,建立转基因小鼠皮下接种结肠癌移植瘤模型,研究IAP对小鼠体内肿瘤生长的抑制效果,为IAP在肿瘤免疫治疗中的开发和应用提供初期数据支持。本研究使用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测IAP与人、小鼠、猴PD-1和IL-2Rβ蛋白的结合能力;利用生物膜层干涉(biofilm layer interference,BLI)技术,考察IAP与Fc受体的亲和力;采用流式细胞分选(fluorescence activated cell sorting,FACS)技术检测IAP与CHOK1-PD-1细胞的结合能力,报告基因法考察阻断PD-1/PD-L1信号通路的能力;通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)法和CCK-8(cell counting kit-8)法检测IAP的抗体和补体依赖的细胞毒性作用;应用FACS技术探究IAP与人PBMC中各亚群细胞的结合活性、增殖作用和激活能力。建立转基因小鼠皮下接种结肠癌移植瘤模型,将MC38-h PD-L1细胞皮下接种于h PD-1转基因小鼠右后背,肿瘤接种一周后,将荷瘤鼠随机分为溶媒对照组、实验组以及阳性对照组,均采用腹腔注射的给药方式,溶媒对照组给予生理盐水,实验组给予0.1、0.5和1mg/kg的IAP,阳性对照组给予0.5mgPD0325901/kg帕博利珠单抗(Keytruda),每3天给药1次,共给药8次。首次给药后第31天处死小鼠。每天对小鼠的生存状态进行观察,每3天1次对小鼠称重,并测量肿瘤长短径,监测肿瘤生长情况。研究结果表明,IAP可以特异性结合人、biotic stress猴PD-1和人、小鼠、猴IL-2Rβ蛋白,与小鼠PD-1蛋白不结合;IAP与Fc受体的亲和力低于Ig G1亚型;IAP可以特异性结合CHOK1-PD-1细胞,阻断PD-1/PD-L1信号通路,结合和阻断的EC_(50)值分别为0.16n M和0.24n M;IAP无Fc段介导的抗体依赖的细胞毒性作用(antibody dependent cell mediated cytotoxicity,ADCC)和补体依赖的细胞毒性作用(complement dependent cell mediated cytotoxicity,CDC);IAP与人PBMC中的NK、CD8~+T、CD4~+T细胞具有结合活性,浓度依赖性的刺激PBMC增殖,主要的群体为CD8~+T细胞和NKT细胞,并激活PBMC分泌干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ);在h PD-1转基因小鼠皮下接种结肠癌细胞系MC38-h PD-L1的移植瘤模型中,与溶媒对照组比较,IAP在0.1、0.5和1mg/kg剂量下能够显著地抑制肿瘤生长,同等剂量下,IAP的抑瘤作用优于Keytruda。综上所述,IAP可以结合人、猴PD-1蛋白以及人、小鼠、猴IL-2Rβ蛋白,与Fc受体的亲和力较低;未见抗体和补体依赖的细胞毒性作用;可与CHOK1-PD-1细胞结合,阻断PD-1/PD-L1信号通路;IAP能与人PBMC中的NK细胞、CD8~+T细胞和CD4~+T细胞结合,对PBMC中的CD8~+T细胞和NKT细胞具有浓度依赖性的激活和增殖作用,并可激活PBMC分泌IFN-γ。在h PD-1转基因小鼠皮下移植瘤模型上初步验证了其良好的抗肿瘤特性,为后续寻找肿瘤患者Talazoparib的治疗手段提供新的方向和思路。