苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)是侵染梨和苹果等仁果类果树的重要病毒之一,在感病的梨和苹果植株叶片上引起褪绿斑。ACLSV是芜菁黄花叶病毒目(Tymovirales)乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)纤毛病毒属(Trichovirus)的典型种。该病毒的基因组为7.5-8.0 kb的正义单链RNA(positivesense single-stranded RNA,+ss RNA),包含3个部分重叠的开放阅读框(open reading framehttps://www.selleck.cn/products/MK-1775.html,ORF),其中ORF2编码属于“30 K”超家族的运动蛋白(movement protein,MP)。鉴定与病毒互作的寄主蛋白,可为深入了解病毒生物学特性及作用靶标等提供重要信息。本研究采用酵母双杂交(yeast two-hybrid system,Y2H)方法筛选到与ACLSV MP互作的梨蛋白,并进一步验证互作结果,分析互作特点。主要研究结果如下:(1)以p GBKT7-MP为诱饵载体,从红香酥梨cDNA文库中初步筛选到了39种与MP互作的梨蛋白,主要包括与泛素化、磷酸化、光合作用、糖代谢、嘌呤代谢、氨基酸的生物合成、次生代谢物的生物合成、蛋白质的加工及分解代谢、信号转导及转录调控等相关蛋白。根据候选蛋白的生物信息学分析结果,选择了12个梨蛋白,经酵母双杂交(Y2translation-targeting antibioticsH)、双分子荧光互补(BiFC)和荧光素酶互补试验(LCA)进一步分析,确认泛素连接酶(probable BOI-related E3 ubiquitin-protein ligase 2,E3)、蛋白质磷酸化酶(probable protein phosphatase 2C 47,PP2C)、细胞周期蛋白(cyclinP3-1-like,Cyc)、6-磷酸山梨醇脱氢酶(NADP-dependent sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,Nd S6PDH)、索马甜类蛋白(thaumatin-like proteE-616452半抑制浓度in 1b,TLP)、分支酸变位酶(chorismate mutase 1,CM)、叶绿素ab结合蛋白(chlorophyll a-b binding protein CP24 10A,CP24)和(chlorophyll a-b binding protein 6,LHCB6)可以与MP互作,且Bi FC试验表明互作位置均为胞间连丝(plasmodesmata,PD)。(2)对MP及互作蛋白进行了亚细胞定位分析,发现MP定位于PD;E3定位在细胞核和PD;PP2C、Nd S6PDH、Cyc和TLP定位在细胞核和细胞膜,其中PP2C和Nd S6PDH还定位在内质网(endoplasmic reticulum,ER);CM、CP24和LHCB6均以不均匀的颗粒状定位在叶绿体。除LHCB6外,这些梨蛋白均与MP在PD处共定位。同时鉴定明确MP的PD定位信号位于N端的11-201 aa,MP可自身互作的关键区域为19-312 aa,且MP与梨蛋白CP24和Cyc互作的关键氨基酸序列为11-201 aa。(3)初步研究了MP与这些互作蛋白的生物学功能,发现MP与来自本氏烟的蛋白NbCP24、NbLHCB6和NbCyc均互作。基于病毒诱导的基因沉默下调本氏烟中基因NbLHCB6和NbCyc表达,未诱导明显的表型变化,而基因NbCP24下调表达可引起烟草叶片褪绿和花叶。综上所述,本研究鉴定到与ACLSV的MP互作的8种梨蛋白,明确了互作蛋白的亚细胞位点及潜在生物学功能。