目的:砷是自然界广泛存在的类金属元素,长期砷暴露可导致多种全身性疾病,甚至可诱发多种癌症。巨噬细胞作为人体免疫的第一道防线,在抵抗病原过程中发挥着重要作用。巨噬细胞受周围环境影响可改变自身表型,其中主要分为M1型即经典活化和M2型即替代性活化的巨噬细胞,M1型和M2型巨噬细胞分别有促炎和抗炎等生物学功能,在肿瘤微环境中参与细胞间的相互作用。聚集到肿瘤周围组织中的巨噬细胞在肿瘤浸润和转移过程中扮演着重要角色,被称为肿瘤相关巨噬细胞Adezmapimod MW,其主要表现为M2型巨噬细胞的特征,通过增强肿瘤细胞的运动性、促进血管生成和降解细胞外基底层来促进肿瘤转移。MiRNAs可以调节发育、代谢、细胞增殖、生长、分化和死亡等许多病理生理过程,其中miRNA-125家族在巨噬细胞极化及肿瘤发展过程中起到了重要作用,但miR-125家族是否调控砷诱导的巨噬细胞极化尚未见文献报道。为此,我们的研究通过建立亚砷酸钠诱导巨噬细胞极化模型,探讨miR-125a-5p在其极化中的作用。方法:1.体内实验:建立大鼠亚慢性饮水砷暴露模型,将18只大鼠随机分为3组:对照组、10 mg/L染砷组,50 mg/L染砷组,连续染毒12周后处死,取肝和膀胱组织,石蜡包埋并切片。Western Blot法和免疫荧光染色法检测大鼠肝和膀胱组织中M1型和M2型巨噬细胞标志物(CD206、Arg1、iNOS、IL-1β和TNF-α)表达。2.体外实验:不同浓度佛波酯(PMA)刺激THP-1细胞48 h,观察细胞形态,流式细胞术检测巨噬细胞标志物CD1 1b的表达;CCK8检测不同浓度亚砷酸钠(NaAsO2)处理48 h后的细胞活力;RT-qPCR和Western Blot法检测NaAsO2处理THP-1来源巨噬细胞48 h后M1型和M2型巨噬细胞标志性基因和蛋白的表达;免疫荧光染色法检测CD206和IL-1β的荧光强度;RT-qPCR检测miR-125a-5p mRNA表达水平;miRDB、Targetscan和miRTarBase三个数据库及DAVID数据库GO富集分析筛选miR-125a-5p结合位点;构建miR-125a-5p过表达模型,Western Blot法检测miR-125a-5p过表达后IRF4及NaAsO2处理THP-1来源巨噬细胞M1型和M2型标志性蛋白的表达。结果:1.体内实验:大鼠饮水砷暴露12周后,在肝组织中发现,M2型巨噬细胞标志物CD206和Arg1显著高于对照组(P<0.01),M1型巨噬细胞标志物iNOS和IL-1β显著低于对照组(P<0.05);在膀胱组织中,与对照组相比,M2型巨噬细胞标志物CD206和Arg1显著升高(P<0.01),而M1型巨噬细胞标志物TNF-α和IL-1β显著降低(P<0.05)。2.分化后THP-1细胞的形态学特征:与单核细胞相比,PMA处理后的THP-1细胞从悬浮生长状态转化成贴壁生长,伸出伪足,并停止分裂增殖,细胞质体积增加;不同浓度PMA处理后,CD11b细胞数量明显高于对照组(P<0.001),而80nM和160nMPMABucladesine临床试验诱导巨噬细胞的效果,两剂量组比较无统计学差异。3.NaAsbioactive packagingO2对THP-1来源巨噬细胞活性的影响:4 μMNaAsO2或更高剂量处理后,巨噬细胞活性显著降低(P<0.05),其中12 μMNaAsO2处理后细胞活性低于50%。4.NaAsO2诱导THP-1来源巨噬细胞相关基因的表达:不同剂量NaAsO2诱导THP-1来源巨噬细胞48h处理后,CD206、Arg1、IL-10mRNA水平显著高于对照组(P<0.05)。Arg1、IL-10mRNA水平与IL-4处理组相比无显著差异;IL-1β和TNF-αmRNA水平显著低于对照组(P<0.05),与IL-4组相比存在统计学差异(P<0.01)。4 μM NaAsO2处理后VEGF mRNA水平显著低于对照组,其他处理组与对照组相比无统计学差异。5.NaAsO2诱导THP-1来源巨噬细胞相关蛋白的表达:与对照组相比,NaAsO2和IL-4两处理组CD206免疫荧光强度明显变强,IL-1β荧光强度明显变弱;8 μMNaAsO2和IL-4两组中CD206、Arg1和IL-10蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01)。而IL-1β、TNF-α和iNOS蛋白表达水平显著低于对照组(P<0.05);VEGF蛋白表达水平与对照组相比无显著差异。6.NaAsO2诱导THP-1来源巨噬细胞miR-125a-5p表达:8μM NaAsO2和IL-4两处理组miR-125a-5p mRNA水平显著低于对照组(P<0.05)。7.MiR-125a-5p 靶基因预测:miRDB,Targetscan,miRTarBase三个数据库及DAVID数据库GO富集分析发现IRF4作用靶点;Targetscan数据库寻找发现 miR-125a-5p 与 IRF4 3’-UTR 592-599 位点结合;构建 miR-125a-5p 过表达模型,对照或NaAsO2或IL-4-miR-mimic组与对照或NaAsO2或IL-4处理组相比,miR-125a-5pmRNA水平均显著升高(P<0.001),而对照或NaAsO2或IL-4-miR-NC组与对照或NaAsO2或IL-4处理组相比无统计学差异;8 μM NaAsO2和IL-4两处理组中IRF4蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.05);miR-125a-5p过表达后,与对照-miR-NC组相比,NaAsO2或IL-4-miR-NC中IRF4蛋白水平显著升高(P<0.01),而对照-miR-NC与对照-miR-mimic两组相比无统计学差异;NaAsO2或IL-4-miR-mimic 与 NaAsO2 或 IL-4-miR-NC 相比 IRF4 蛋白水平显著下降(P<0.01)。8.MiR-125a-5p过表达后NaAsO2诱导巨噬细胞极化相关蛋白的表达:miR-125a-5p过表达后,与对照-miR-NC 组相比,NaAsO2 或 IL-4-miR-NC 中 CD206、Arg1 和 IL-10 蛋白水平显著升高(P<0.01),iNOS、IL-1β和TNF-α蛋白水平显著下降(P<0.05),对照-miR-mimic较对照-miR-NC组相比M2型标志物无统计学差异,而M1型标志物IL-1β蛋白水平显著升高(P<0.01),iNOS和TNF-α蛋白无统计学差异;与NaAsO2-miR-NC和IL-4-miR-NC 相比,NaAsO2-miR-mimic和IL-4-miR-mimic 组 CD206、Arg1和IL-10蛋白水平显著下降(P<0.05),而iNOS、IL-1β和TNF-α蛋白水平水平显著升高(P<0.01)。结论:1.亚砷酸钠可诱导巨噬细胞发生M2型极化。2.亚砷酸钠通过降低miR-125a-5p含量,促进靶蛋白IRF4升高,进而诱导THP-1来源的巨噬细胞发生M2型极化。