卵巢癌是一种对铂类药物敏感的肿瘤,一线常规治疗通常有较高的疗效。然而,75%的晚期患者在接受顺铂(Cis[Pt Cl_2(NH_3)_2],DDP)治疗一段时间后仍会发生转移和/或复发,顺铂耐药性最终会影响癌症患者的长期生存率。卵巢癌对顺铂耐药的机制很复杂,研究表明,它可能与药物外排增加、表观遗传改变、DNA修复增强和自噬激活有关。尽管自噬在肿瘤形成过程中的促生长和促死亡作用仍有争议,大量研究支持在化疗药物引起的微环境压力下,肿瘤细胞将刺激自噬作为对抗化疗药物细胞毒性的保护机制,最终导致化疗耐药性的出现。铁死亡是一种铁依赖性的细胞程序性死亡方式。在二价铁离子或酯氧合酶的作用下,催化细胞膜上不饱和脂肪酸发生脂质体过氧化,从而诱导细胞死亡。某些耐药肿瘤细胞,特别是间充质状态的、易转移的肿瘤细胞,极易发生铁死亡,但具体机制不明。因此,明确耐药卵巢癌细胞对铁死亡激活剂的易感性可能为卵巢癌临床治疗提供新的视角。抗氧化体系失活和铁代谢紊乱是影响细胞铁死亡敏感性的重要因素。一种被称为x CT(SLC7A11)的胱氨酸-谷氨酸反转运蛋白有助于从头合成抗氧化剂谷胱甘肽(Glutathione,GSH)。GSH在催化磷脂氢过氧化物解毒中的作用对细胞生存至关重要。GSH也是谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase 4,GPX4)的底物。因此,半胱氨酸剥夺和GPX4抑制可以有效地诱导铁死亡。GPX4抑制剂RSL3以及SLC7A11的直接抑制剂Erastin被广泛用于诱导铁死亡。增加铁的吸收,减少铁的储存和限制铁的外流都会导致铁积累增加,促进铁死亡。转铁蛋白通过介导铁摄取影响细胞铁积累,而铁蛋白的合成和降解均能影响铁水平。细胞质中过量的铁离子储存在由铁蛋白重链FTH1和铁蛋白轻链FTL1组成的铁蛋白复合体中。与对铁死亡敏感的细胞相比,FTH1和FTL1在对铁死亡不敏感的细胞中的表达量显著增加。最近的研究指出,铁死亡可能是自噬依赖性的。这是因为对铁死亡激活剂的反应导致自噬体的积累,而自噬机制的成分有助于铁死亡的发生。此外,铁蛋白的自噬降解可以增加细胞内的不稳定铁离子水平,使细胞对铁死亡更加敏感。本研究通过使用两个卵巢癌亲本和顺铂耐药细胞系,我们发现顺铂耐药的卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂Erastin更敏感。进一步研究发现,顺铂耐药细胞的高自噬水平导致了游离铁离子水平的增加。动物实验表明Erastin和DDP联合应用对耐药卵巢癌细胞具有良好的治疗效果。重要的是,自噬抑制分子AKT1在顺铂治疗不敏感卵巢癌患者中表达显著降低。因此,我们假设顺铂耐药卵巢癌细胞通过维持高自噬水平应对化疗压力,这种自噬状态启动了铁蛋白FTH1/FTL1的降解并导致铁离子的释放,进而导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂更加敏感。本研究旨在阐明铁死亡与卵巢癌顺铂耐药之间的联系,为明确AKT1/FTH1途径在顺铂耐药卵巢癌铁死亡中的作用提供科学依据,对靶向铁死亡途径逆转顺铂耐药提供新的策略。方法:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证SKOV3和A2780顺铂耐药卵巢癌细胞株(记为Res)及亲本细胞株(记为Par)由课题组前期构建,实验前分别经0、2.5、5、10及20μM顺铂处理,CCK8法检测亲本细胞和耐药细胞活力。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力。ELISA法检测MDA、GSH、SOD水平,铁离子比色法检测游离铁水平。荧光探针染色检测ROS水平。Ferrostatin-1预处理细胞后再经Erastin杀伤,CCK8法评估细胞活力以明确顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤针对SKOV3-Res及A2780-Res细胞分别进行顺铂单药或顺铂联合Erastin处理。使用CCK8法测定细胞活力,使用钙黄绿素/PI分别对活/死细胞进行染色以判NSC 119875断凋亡率。(2)Erastin增强顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果将2×10~6个SKOSecond-generation bioethanolV3-Res细胞悬液对C57BL/6雌性小鼠进行腹腔注射,制备卵巢癌腹腔转移模型。一周后,小鼠接受三种不同治疗:对照(DMSO,0.05%)、DDP(4mg/kg)或DDP(4mg/kg)+Erastin(1mg/kg)。小鼠每3天腹腔注射一次药物,持续4周。统计小鼠生存时间,腹水量,腹壁转移瘤数目,HE染色检测转移瘤对腹壁侵犯情况。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中GPX4、NRF2和SLC7A11蛋白水平进行Western Blot检测。RT-PCR对NRF2靶基因HO1和NQO1进行检测。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调分别在有/无Erastin处理条件下对亲本及DDP耐药的SKOV3及A2780细胞中铁蛋白FTL1及FTH1进行Western Blot检测。RT-PCR法检测铁蛋白FTL1及FTH1的m RNA表达。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加以10μ/m L放线菌酮(Cycloheximide,CHX)处理细胞阻断新蛋白的合成,以观察FTH1在亲本细胞和耐药细胞中的蛋白稳定性。FTH1质粒转导SKOV3-Res和A2780-Res细胞后,以活/死染色和CCK8法检测细胞对Erastin诱导的铁死亡的反应。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体,免疫荧光染色检测顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达。使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,CCK8法评价顺BMN 673化学结构铂耐药卵巢癌细胞对Erastin杀伤的敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例顺铂治疗完全应答(Complete response,CR)患者和10例不完全应答(Incomplete response,IR)患者的测序结果进行比对,分析顺铂耐药的差异基因,KEGG分析差异基因所富集的分子通路,免疫组化染色检测CR与IR患者卵巢癌组织AKT1的表达。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析通过TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系。AKT1由中位表达水平分为高表达组及低表达组,Nomogram模型用于评估卵巢癌患者AKT1丢失的风险。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1,Western Blot检测AKT1、LC3b、p-ULK1及FTH1的表达。CCK8法检测在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡情况。结果:1.顺铂耐药卵巢癌细胞铁死亡敏感性增加(1)顺铂耐药卵巢癌细胞株的验证与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/SKOV3-Par=10.717,IC50/SKOV3-Res=23.830)。与亲本细胞相比,A2780-Res细胞对顺铂具有更强的耐药性(IC50/A2780-Par=9.528,IC50/A2780-Res=25.591)。以上结果说明,SKOV3和A2780顺铂耐药卵巢癌细胞株构建成功。(2)顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感性增加(1)使用20μM Erastin对卵巢癌亲本及耐药细胞株处理24h,CCK8法评估细胞活力,与亲本细胞相比,SKOV3-Res细胞和A2780-Res细胞活力均显著降低。Erastin处理后,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780细胞中SOD和GSH水平均显著降低,MDA水平增加。细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一,Erastin处理后,顺铂耐药的SKOV3和A2780细胞中亚铁离子水平均显著高于亲本细胞。脂质ROS的增加是细胞发生铁死亡的重要特征,Erastin处理后SKOV3-Res及A2780-Res细胞中的ROS水平显著高于对应的亲本细胞。(2)预先使用10μM Fer-1处理细胞2h后评估Erastin的杀伤效果,发现抑制铁死亡途径挽救了Erastin对亲本和顺铂耐药卵巢癌细胞的杀伤。这些结果说明,与亲本细胞相比,顺铂耐药卵巢癌细胞具有高铁死亡敏感性。2.靶向铁死亡途径逆转卵巢癌顺铂耐药(1)Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤相比于单独顺铂治疗,顺铂联合Erastin处理导致耐药卵巢癌细胞细胞活力显著降低,凋亡率显著增加。提示,在体外实验中Erastin增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤。(2)Erastin增强顺铂对小鼠卵巢癌耐药模型的治疗效果与单独DDP治疗组小鼠相比,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的腹壁转移性肿瘤更少,DDP+Erastin联合治疗组小鼠的转移瘤对腹壁的侵袭更低,腹水体积更小,中位生存时间更长。以上结果说明,Erastin与顺铂联合治疗在体外及体内实验中均表现出对顺铂耐药卵巢癌更强烈的杀伤效果。3.顺铂耐药卵巢癌细胞通过FTH1自噬降解对铁死亡易感(1)顺铂耐药卵巢癌的Erastin敏感性不依赖于铁死亡防御系统(1)在未经Erastin杀伤的情况下,铁死亡防御系统的关键分子在SKOV3-Res细胞中的表达显著高于SKOV3-Par细胞。Erastin显著诱导了NRF2和SLC7A11的上调,且不改变SKOV3-Res细胞及SKOV3-Par细胞的表达差异。然而,Erastin对SKOV3-Res细胞中的GPX4表达呈现强烈的抑制作用。经Erastin治疗后,GPX4在SKOV3-Res细胞中的表达显著低于其亲本细胞。(2)在未经Erastin杀伤的情况下,GPX4、NRF2和SLC7A11在A2780-Res细胞中的表达显著高于A2780-Par细胞。Erastin处理导致了GPX4在A2780-Res细胞中显著下调。RT-PCR结果显示顺铂耐药卵巢癌细胞中NRF2靶基因HO1和NQO1的增加,证明了抗ROS系统活性的增强。以上结果表明,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin的高敏感性似乎并不依赖于铁死亡防御系统的失活。(2)铁蛋白FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中下调经Western Blot检测转铁蛋白FTL1及FTH1发现,与亲本细胞相比,SKOV3-Res和A2780-Res细胞中FTH1蛋白水平增加,但FTL1蛋白水平没有增加。Erastin处理后FTH1和FTL1的蛋白表达受到抑制,但顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达水平仍低于其亲本细胞。RT-PCR结果显示,与亲本细胞相比,顺铂耐药细胞中FTH1的m RNA水平没有显著差异。这些数据表明了FTH1受到转录后调节的可能性。(3)FTH1在顺铂耐药卵巢癌细胞中降解增加(1)以10μ/m L CHX处理细胞阻断新蛋白的合成,以未经CHX处理的细胞中FTH1蛋白的表达为起始标准值,发现顺铂耐药卵巢癌细胞中FTH1蛋白的降解率与亲本细胞相比显著增加。(2)在顺铂耐药卵巢癌细胞中恢复FTH1蛋白表达后,顺铂耐药卵巢癌细胞对Erastin诱导的铁死亡敏感性降低。表明顺铂耐药卵巢癌细胞可能通过促进FTH1的降解而增加LIP中游离铁离子的水平,可能是铁死亡敏感性增加的原因。(4)顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平增加(1)通过透射电镜观察了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞的自噬小体情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的自噬小体较对应亲本细胞增加。通过免疫荧光染色检测了顺铂耐药卵巢癌细胞及亲本细胞中自噬标志物LC3b的表达情况,发现SKOV3-Res及A2780-Res细胞的LC3b表达高于对应亲本细胞。说明顺铂耐药卵巢癌细胞维持较高的自噬水平。(2)使用自噬抑制剂3-MA处理后,Western Blot检测FTH1蛋白的表达情况,发现阻断自噬恢复了FTH1的蛋白表达。提示顺铂耐药卵巢癌细胞的高自噬水平导致了FTH1的蛋白降解。(3)3MA处理导致SKOV3-Res和A2780-Res细胞对Erastin杀伤的敏感性降低。上述结果提示,高自噬水平导致的FTH1降解介导了顺铂耐药卵巢癌细胞的铁死亡敏感性。4.顺铂耐药卵巢癌细胞中AKT1缺失介导FTH1自噬降解(1)基于GEO数据库筛查卵巢癌顺铂耐药差异基因通过对GEO数据库GSE23603中17例CR患者和10例IR患者的测序结果进行比对,发现IR患者的测序结果中自噬抑制分子AKT1显著降低。KEGG富集分析表明,CR及IR患者差异基因在MAPK及PI3K-AKT途径中富集。IR患者卵巢癌组织中AKT1表达显著下调。(2)AKT1缺失与卵巢癌预后的关联分析TCGA数据库分析AKT1表达水平与卵巢癌预后的关系,发现AKT1低表达可能预示着较短的生存时间和不良预后。生存分析发现,卵巢癌患者中AKT1的表达缺失与低总生存率、低疾病特异性生存率及更短的无进展间隔有关。这些结果说明,AKT1的丢失是卵巢癌的不良预后因素。(3)AKT1缺失上调顺铂耐药卵巢癌细胞自噬水平在SKOV3-Res和A2780-Res细胞中转导外源性AKT1时,p ULK1降低,LC3b表达增加,表明顺铂耐药细胞通过下调AKT1维持自噬。恢复AKT1表达后耐药卵巢癌细胞中FTH1的表达被挽救。在顺铂耐药的卵巢癌细胞中恢复AKT1表达后,Erastin诱导的细胞铁死亡减少。表明AKT1的丢失可能是顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡诱导剂高度敏感的原因,这是由p-ULK介导的FTH1自噬降解引起的。结论:1.AKT1的缺失导致顺铂耐药卵巢癌细胞维持高自噬水平;2.AKT1缺失介导的FTH1自噬降解导致顺铂耐药卵巢癌细胞对铁死亡敏感;3.靶向铁死亡可能是逆转卵巢癌顺铂耐药的潜在途径。