三阴性乳腺癌是乳腺癌中一类预后较差的亚型,目前尚无有效的治疗靶点。G蛋白偶联雌激素受体(GPER)作为一种新型雌激素受体,可以介导三阴性乳腺癌(TNBC)细胞的雌激素作用,促进肿瘤的恶性进展及药物耐药。然而,GPER在肿瘤相关成纤维细R428采购胞(CAFs)中的作用尚不清楚,而同时CAFs又是肿瘤微环境中的主要细胞成分。本研究将探索GPER在三阴性乳腺癌中通过调控肿瘤微环境影响三阴性乳腺癌进展及免疫逃逸的分子机制。第一部分:晚期三阴性乳腺癌微环境CAFs中GPER的表达及其临床意义目的:探索乳腺癌微环境中CAFs上GPER的表达情况及其与PD-L1表达、临床病理变量间的相关性。方法:应用免疫组织化学检测91例已接受PD-1/PD-L1抑制剂免疫治疗的TNBC患者组织标本。分析这些组织中肿瘤间质GPER、肿瘤实质GPER及肿瘤实质PD-L1表达情况及其之间的相关性。将GPER的表达与患者的临床信息结合,使用Kaplan-Meier分析肿瘤实质GPER、肿瘤间质GPER表达高低与患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后无疾病进展生存时间(PFS)的关系。使用单因素及多因素Cox回归探索患者接受PD-1/PD-L1抑制剂之后PFS的影响因素。结果:(1)GPER在肿瘤间质表达高低与肿瘤大小(T)、区域淋巴结转移(N)、病理分期显著相关(p<0.05);与患者年龄、月经状态、肿块部位及组织学分级无明显统计学相关性(p>0.05);(2)GPER在肿瘤实质中表达高低与年龄、肿瘤大小(T)、区域淋巴结转移(N)、病理分期、月经状态、组织学分级及肿块部位无明显统计学相关性(p>0.05);(3)通过Spearman相关性分析,发现肿瘤间质GPER表达与肿瘤实质PD-L1表达呈正相关(p<0.001,R=0.724);肿瘤实质GPER表达与肿瘤实质PD-L1表达呈正相关,但是统计学无意义(p=0.074,R=0.188);4)以间质GPER IHC评分将患者分高低两组,两组患者的中位PFS有明显统计学(p<0.001),两组患者中位PFS时间相距120天(145天vs.265天);而以实质GPER IHC评分将患者分高低两组时,两组患者的PFS无明显统计学(p=0.675),两组患者中位无进展生存时间差异80天(225天vs.145天);5)GPER间质表达水平是晚期三阴性乳腺癌患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后,影响患者PFS的独立危险因素。结论:GPER肿瘤间质表达高低是晚期三阴性乳腺癌患者接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗后PFS的独立危险因素。第二部分:细胞质GPER介导肿瘤相关成纤维细胞与肿瘤细胞相交互并促进乳腺癌进展的分子机制目的:探索肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中GPER调控三阴性乳腺癌(TNBC)增殖、凋亡及侵袭的分子机制方法:使用TNBC细胞与CAFs细胞共培养系统,通过E2及G15等药物激活或抑制CAFs中GPER的功能。使用免疫印迹法检测信号通路轴中相关蛋白改变情况,使用CCK-8、流式细胞术及侵袭实验检测TNBC细胞增殖、凋亡及侵袭情况。相关试剂盒检测葡萄糖消耗量、乳酸、丙酮酸、谷氨酰胺、ATP、乙酰辅酶A、琥珀酸生成量。使用染色质免疫共沉淀(Ch IP)实验检测GLUL转录因子结合情况。原位异种移植瘤实验和肺转移瘤实验检测在体外模型中,CAFs上GPER对TNBC的生物学效应。结果:(1)E2(GPER激活剂)激活CAFs细胞质GPER时,细胞内和细胞外培养基谷氨酰胺的产生都会增加,而当同时加用G15(GPER拮抗剂)时谷氨酰胺的产生会受到抑制;在激活细胞质GPER的CAFs中敲低GLUL,细胞内和条件培养基中的谷氨酰胺减少;(2)E2激活CAFs细胞质GPER时,BT-549和MDA-MB-231的S期占比、细胞增殖、细胞侵袭和表柔比星耐药性增强,细胞凋亡减少;同时,当敲除GLUL或在E2刺激CAFs同时使用G15处理,以上表型会得以回复;(3)随着激活CAFs细胞质中GPER,c AMP、磷酸化PKA、磷酸化CREB和GLUL表达增加;而同时使用G15时,这些分子的改变得以回复。Ch IP试验证实CREB可以结合GLUL启动子。GPER或CREB的敲低显著降低CAFs和条件培养基中谷氨酰胺的产生;(4)体内实验证实:与注射MDA-MB-231和对照CAFs混合肿瘤负荷小鼠相比,注射MDA-MB-231和CAFs(CAFs/sh GPER、CAFs/sh GLUL、CAFs/sh GPER+sh GLUL)的小鼠肿瘤较小、生长较慢及肺转移瘤数目更少。结论:雌激素E2激活CAFs细胞质GPER/c AMP/PKA/CREB信号通路轴,进而增强GLUL的表达,促进谷氨酰胺的合成和分泌,进一步调控癌细胞增殖、凋亡及侵袭。第三部分:肿瘤微环境中CAFs中GPER通过分泌谷氨酰胺调控三阴性乳腺癌免疫逃逸分子机制目的:探索肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中GPER调控三阴性乳腺癌(TNBC)免疫逃逸的分子机制。方法:使用三阴性乳腺癌细胞与CAFs细胞及乳腺癌细胞与Jurkat T共培养系统,通过E2、G1及G15等药物刺激CAFs中GPER的功能;通过细胞免疫荧光及免疫印迹法检测三阴性乳腺癌细胞中PD-L1表达及相关信号通路激活情况;通过乳腺癌细胞杀伤实验及流式细胞仪检测TNBC细胞凋亡情况。结果:(1)当含有E2或G1的条件培养基(CM)刺激CAFs细胞后的上清液,处理BT-549和MDA-MB-231后,肿瘤细胞上PD-L1表达升高;当在E2刺激CAFs的同时加用G15处理,肿瘤细胞上的PD-L1表达下降;(2)当含有E2或G1的CM刺激CAFs细oral oncolytic胞后的上清液,处理BT-549和MDA-MB-231后,肿瘤细胞内磷酸化EGFR(p EGFR)、磷酸化ERK(p-ERK)、磷酸化c-Jun(p-c-JUN)和PD-L1表达增加;当使用E2与G15共同处理CAFs时,以上蛋白变化得以回复;当使用含有E2的CM刺激CAFs的细胞培养上清液处理与Jurkat T共培养的MDA-MB-231和BT-549时,肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。而使用含有E2+G15的CM刺激CAFs的细胞培养上清液处理与Jurkat T共培养的MDA-MB-231和BT-549细胞存活量下降,凋亡更多;(3)当含有E2的CM刺激CAFs细胞后的上清液处理BT-549和MDA-MB-231,细胞内相关通路磷酸化蛋白及PD-L1表达升高。此时,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。相反地,当在E2刺激CAFs中同时使用sh ASCT2(谷氨酰胺转运体)处理肿瘤细胞时,BT-549和MDA-MB-231上相关通路蛋白磷酸化及PD-L1表达下降,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更少,凋亡更多;(4)当含有E2的CM刺激CAFs细胞后的上清液处理BT-549和MDA-MB-231,乳腺癌细胞内相关通路蛋白磷酸化及PD-L1表达升高。此时,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更多,凋亡更少。当在E2刺激CAFs中同时使用AG126(ERK1/2磷酸化抑制剂,25μM)处理肿瘤细胞时,BT-549和MDA-MB-231上相关通路磷酸化蛋白及PD-L1表达下降,与Jurkat T共培养的肿瘤细胞存活量更少,凋亡更多。结论:雌激素激活CAFs细胞质中GPER改变肿瘤微环境中的谷氨酰胺,三阴性乳腺癌细胞通过ASCT2转运微环境中的谷氨酰胺至细胞内,激活细胞内的EGFR/ERK/c-Jun信号通路,从而改变自身PD-L1的表达,进而影响Jurkat 确认细节T细胞对三阴性乳腺癌的免疫杀伤。