研究背景:哮喘是一种异质性的肺部慢性炎症性疾病,具有多种表型,以气道炎症、粘液高分泌、气道高反应性为特征。气道炎症是以气道上皮下多种炎性细胞的长期慢性浸润为特征。气道炎症细胞浸润会引发粘液高分泌,加重气道高反应以及气道重塑,进而导致固定性气流受限及肺功能不可逆性下降。气道炎症是哮喘的病理生理学、临床特征和风险易感性的中心,也是治疗的目标。巨噬细胞是重要的先天免疫细胞,具有多种多样的功能,这些功能包括识别、响应和破坏入侵微生物,抗原呈递,通过清除细胞碎片维持组织和免疫稳态,以及产生炎症调节产物。研究表明,巨噬细胞不仅通过执行抗炎功能来维持肺内稳态,而且可能是与哮喘相关的炎症和组织损伤机制的组成部分。巨噬细胞可以通过几种方式促进哮喘炎症,这些方式包括改变(抗)炎症细胞因子/趋化因子的产生,炎症小体的诱导,以及改变的细胞过程,如吞噬功能缺陷。炎症小体是一种由胞浆内模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)参与组装的多蛋白复合物,在机体受到刺激后可出现在免疫及非免疫细胞中,其中NOD样受体(NOD-like-receptor,NLR)热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎症小体在人体的固有免疫中发挥重要作用,近年来受到广泛关注。NLRP3炎性小体在风湿免疫性疾病、阿尔茨海默病、帕金森病、心肌梗塞等患者中高表达,在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病中也存在高表达。NLRP3炎性小体激活后释放IL-1β、IL-18等炎症因子诱导免疫反应,与哮喘的发病密切相关。在哮喘患者中,NLRP3炎性小体主要表达于肺泡巨噬细胞中,调控巨噬细胞NLRP3炎性小体激活有望成为控制支气管哮喘气道炎症的潜在靶点。NLRP3炎性小体的激活过程包括装配和激活两个步骤,装配指NLRP3炎性小体的非活性部分(NLRP3、ASC、pro-caspase-1)的转录、翻译并低聚化组合,激活指在激活剂存在下,pro-caspase-1活化为成熟caspase-1并切割proIL-1β和proIL-18,形成具有活性的IL-1β和IL-18,进而参与炎症反应过程。NLRP3炎性小体的激活过程涉及复杂的调控网络,其核心是NLRP3的调控。NLRP3的调控包括转录调控,转录后调控,以及翻译后修饰三个环节,翻译后修饰包括:NLRP3的磷酸化/去磷酸化,苏素化/去苏素化,泛素化/去泛素化等过程。蛋白质的苏素化修饰是由SUMO(小泛素相关修饰物)蛋白介导的蛋白质修饰过程,可以改变底物蛋白的诸多特征,如细胞内亚定位、酶活性、蛋白质结构和稳定性、转录活性等。体外实验中,腹腔巨噬细胞以及单核细胞诱导分化的巨噬细胞中NLRP3的SUMO化修饰可以促进NLRP3炎性小体的激活,增加促炎因子的释放,但其是否发生于肺泡巨噬细胞,是否参与支气管哮喘气道炎性形成尚不清楚。国内外研究表明,肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体激活在哮喘气道炎症的发生中起至关重要的作用。SUMO化作为蛋白质翻译后修饰的重要环节已被证明可以调节NLRP3表达进而调控巨噬细胞NLRP3炎性小体的激活。但是肺泡巨噬细胞中NLRP3的SUMO化是否可以调控NLRP3炎性小体的激活,是否参与支气管哮喘的气道炎症尚未有相关研究。研究目的:1.探索哮喘患者以及健康对照者诱导痰中IL-1 β浓度及SUMO1mRNA表达差异,并探索哮喘患者中两者之间的关系以及SUMO1mRNA与肺功能之间的关系。2.证实HDM通过增强肺泡巨噬细胞NLRP3的SUMO化促进NLRP3炎性小体的激活。3.探索抑制NLRP3的SUMO化后对HDM诱导的肺泡巨噬细胞NLRP3炎性小体激活的影响。并探求其具体机制。4.动物实验中,给予抑制剂抑制SUMO化,观察抑制SUMO化是否可以减轻HDM致敏的哮喘小鼠气道炎症细胞浸润,减少气道炎性因子释放,降低气道粘液高分泌等。研究方法:1.收集哮喘患者(n=30)及健康对照者(n=30)诱导痰液,分析两组诱导痰中IL-1β浓度及SUMO1 mRNA相对表达量差异,并对两组受试者进行肺功能检查,分析哮喘患polyphenols biosynthesis者中两者相关性以及SUMO1 mRNA与肺功能的相关性。2.肺泡巨噬细胞给予不同浓度HDM刺激后应用Western blot法分析SUMO1,NLRP3/IL-1β通路相关蛋白的表达,免疫共沉淀法(co-immunoprecipitation,CO-IP)法分析 HDM 刺激后 SUMO 化的 NLRP3 的表达。3.应用小干扰RNA干扰SUMO化的限速酶UBC9或者应用SUMO化抑制剂2-D08抑制NLRP3的SUMO化后,应用Western blBIBW2992细胞培养ot法分析肺泡巨噬细胞给予HDM刺激后SUMO1,NLRP3/IL-1β通路相关蛋白的表达,CO-IP法分析SUMO化的NLRP3表达量变化。4.应用小干扰RNA干扰SUMO化的限速酶UBC9或者应用SUMO化抑制剂2-D08抑制NLRP3的SUMO化后,应用RT-PCR法检测肺泡巨噬细胞给予HDM刺激后NLRP3 mRNA的表达selleck抑制剂差异,并应用蛋白降解试验分析NLRP3蛋白的稳定性。5.应用HDM致敏方法建立哮喘小鼠模型,给予SUMO化抑制剂后,应用HE染色、糖原染色以及免疫组化方法评定SUMO化抑制剂对HDM致敏的哮喘小鼠模型气道炎症、杯状细胞比例以及粘液分泌的影响。Elisa法检测肺泡灌洗液炎性细胞因子水平及炎症细胞数量以及嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞的分类计数情况。肺泡灌洗液细胞沉渣用于提取蛋白进行Western blot测定SUMO1,NLRP3/IL-1β通路相关蛋白的表达,CO-IP法分析SUMO化的NLRP3表达量变化。研究结果:1.哮喘患者中IL-1β浓度及SUM01 mRNA水平高于健康对照人群。哮喘患者中两者呈正相关,SUMO1 mRNA表达水平与肺功能呈负相关相关。2.HDM刺激肺泡巨噬细胞后SUMO1蛋白以及NLRP3/IL-1β通路相关蛋白表达增高,且呈浓度依赖性,同时伴随NLRP3 SUMO化增加,HDM在100U/ml时对上述蛋白的刺激作用最强。3.抑制SUMO化后HDM刺激的肺泡巨噬细胞NLRP3/IL-1 β通路相关蛋白表达降低,伴随NLRP3 SUMO化的降低。3.1应用si-UBC9干扰UBC9表达后,HDM刺激的肺泡巨噬细胞NLRP3/IL-1β通路相关蛋白表达降低,伴随NLRP3 SUMO化的降低。3.2应用2-D08抑制SUMO化后,HDM刺激的肺泡巨噬细胞NLRP3/IL-1β通路相关蛋白表达降低,伴随NLRP3 SUMO化的降低。4.抑制SUMO化对NLRP3 mRNA表达无影响,但降低了 NLRP3蛋白的稳定性。5.抑制SUMO化后,可以减轻哮喘小鼠的气道炎症浸润,减少粘液高分泌,减少炎性因子的释放。研究结论:1.HDM通过增强肺泡巨噬细胞NLRP3的SUMO化促进NLRP3炎性小体的激活。抑制SUMO化后可减轻HDM诱导的NLRP3炎性小体的激活。2.抑制NLRP3的SUMO化通过降低NLRP3蛋白的稳定性来减弱炎性小体的激活。3.抑制肺泡巨噬细胞NLRP3的SUMO化可减轻支气管哮喘小鼠的气道炎症细胞浸润,炎性因子分泌以及气道粘液高分泌。