环磷酸腺苷(Cyclic adenosine monophosphate,cAMP)由三磷酸腺苷在腺苷酸环化酶的催化下环化而成,作为第二信使广泛存在于生物体内,对各项代谢活动起着重要的调节作用。在微生物细胞内,ATP不仅是cAMP的直接前体物质,同时为细胞代谢活动正常运行提供能量。因此,适时提高胞内ATP水平有利于增强cAMP的发酵性能。本文以实验室筛选并保藏的节杆菌(Arthrobacter sp.CCTCC 2013431)为生产菌株,通过外源添加低聚磷酸盐,提高胞内ATP水平,增强cAMP发酵性能。利用转录组测序等技术,从不同维度分析低聚磷酸盐促进cAMP发酵合成的生理机制,并提出基于补救途径和ATP高效供给的cAMP高产发酵工艺。具体研究成果如下所示:(1)通过摇瓶实验发现24 h添加2 g/L-broth六偏磷酸钠可以显著提高cAMP的产量,最大Alpelisib分子式达到2.82 g/L,与空白批次相比提高69.88%。在7 L发酵罐上进行发酵实验,发现添加六偏磷酸钠批次的cAMP产量达到3.64 g/L,与空白批次相比提高33.82%,细胞活性与呼吸强度均得到显著提高。对糖代谢、能量代谢以及cAMP合成途径中相关基因转录medical nephrectomy水平分析发现,葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、细胞色素氧化酶、聚磷酸盐酶、腺苷酸环化酶和过氧化氢酶等编码基因转录水平显著上调,表明六偏磷酸钠激活了一条独立于电子传递链之外的ATP合成途径,强化氧化磷酸化过程,强化了磷酸戊糖途径的代谢通量,为cAMP的合成提供了充足的前体物质。同时,核苷酸分解途径相关酶编码基因的转录水平大幅降低,副产物的合成受到抑制。此外,六偏磷酸钠显著提高了胞内还原酶以及与细胞壁/膜合成相关基因的转录水平,提高了细胞抗氧化能力,维持了细胞正常形态和功能。(2)探究氧化胁迫条件下低聚磷酸盐促进cAMP发酵合成的生理机制。通过摇瓶实验确定24 h添加15 mg/L-broth甲萘醌可以诱导节杆菌产生中度氧化胁迫现象,在7 L发酵罐上进行添加甲萘醌与低聚磷酸盐发酵实验。结果表明,六偏磷酸钠有效缓解了由甲萘醌引起的氧化胁迫现象,清除了细胞内大量活性氧,丙二醛含量也显著降低,添加甲萘醌与六偏磷酸钠批次菌体浓度、cAMP产量恢复到寻找更多与空白相当的水平。此外,通过扫描电子显微镜观察发现,与空白相比,24 h添加15 mg/L甲萘醌条件下,各培养阶段菌体均出现不同程度的断裂。偶合添加甲萘醌与六偏磷酸钠时,菌体形态无明显断裂,优于空白和添加甲萘醌批次,表明六偏磷酸钠能够有效保护细胞膜,减少氧化损伤,为cAMP合成提供了良好环境。(3)提出了基于补救途径和ATP高效供给的cAMP发酵工艺。添加次黄嘌呤激活补救途径可以显著提高cAMP发酵性能,但存在发酵周期缩短、菌体浓度低,cAMP产量提高幅度小的问题。分析结果表明,次黄嘌呤诱导节杆菌产生大量活性氧,形成氧化胁迫条件,维持氧化还原平衡和正常代谢消耗大量能量,不利于cAMP的合成。提出了六偏磷酸钠与次黄嘌呤偶合添加的cAMP发酵工艺,cAMP产量达到7.25 g/L,与仅添加次黄嘌呤批次相比提高了111.99%,菌体浓度与cAMP合成速率也得到显著提高。对胞内活性氧与丙二醛水平和节杆菌细胞形态分析发现,六偏磷酸钠有效缓解了由次黄嘌呤引起的氧化胁迫现象,显著降低了胞内活性氧与丙二醛含量,维持细胞正常形态,为cAMP合成提供了有利条件。