目的研究新型电消融技术不可逆电杀伤IRE联合免疫佐剂GC对小鼠胰腺癌pan-02细胞的抗肿瘤效应及免疫调节作用,探索小鼠胰腺癌pan-02细胞发生的死亡以及是否与线粒体凋亡有关,为优化不可逆电杀伤的治疗模式、改善小鼠胰腺癌的微环境、提高肿瘤电消融和免疫药物联合治疗的疗效提供实验依据。方法1、不可逆电杀伤联合GC对小鼠胰腺癌的抗肿瘤效应:在进行动物实验时,将5~6周龄的雌性C57bl/6小鼠备皮,于右侧背部皮下接种1×106个pan-02胰腺癌细胞构建皮下移植瘤模型,当种植瘤最长径达到6~7mm左右时,将荷瘤小鼠随机分为对照组、不可逆电杀伤组和不可逆电杀伤联合GC组,每组10只。对照组不治疗,IRE治疗组采用场强1000v/cm,脉冲60次/分钟方案治疗肿瘤,联合组在进行IRE电压1000 v/cm,脉冲60次/分钟治疗后,注射100μL的免疫佐剂GC,治疗后每隔2天观察小鼠生存率,比较不同治疗方案的抗肿瘤效应。在体外细胞实验中,传代培养pan-02胰腺癌细胞时,先将盖玻片进行高压消毒处理并放进培养皿中,将细胞接种到培养皿中让其生长在载玻片上,待细胞接近长成单层后,随机分成对照组,不可逆biocatalytic dehydration电杀伤处理组,每组3个培养皿。对照组不做处理,IRE组采用场强700 v/cm,脉冲60次/分钟的方案进行治疗,治疗后在每个培养皿中加入FITC-GC溶液共孵育3小时左右,取出盖玻片在共聚焦显微镜下进行观察。2、不可逆电杀伤联合GC对小鼠胰腺癌的免疫调节作用:重复上述步骤构建小鼠pan-02胰腺癌皮下荷瘤模型,当肿瘤最长径达到6~7mm左右时,按上述实验方案对不同分组的小鼠肿瘤进行治疗,每组3~5只小鼠.IRE治疗后第10天,取小鼠的移植瘤和淋巴结:(1)采用蛋白质印迹法Western Blot检测肿瘤组织中的热休克蛋白-70、高迁移率族蛋白-1,观察不同处理对损伤相关分子模式的影响;(2)采用流式细胞术和免疫组织确认细节化学染色检测肿瘤组织和淋巴结中CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞、记忆性T细胞以及效应性T细胞,观察不同处理组对浸润的免疫细胞数量影响;(3)采用流式细胞术检测肿瘤组织和淋巴结中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面的PD-1、LAG-3的表达情况。结果1、不可逆电杀伤联合GC对小鼠胰腺癌的抗肿瘤效应:在体外试验中,相比于对照组,IRE联合GC能增强对胰腺癌细胞的杀伤作用,能够降低50%的生存率;相比于未经处理组,联合治疗也能够降低胰腺癌细胞70%增殖率;在脉冲固定时,场强越强,肿瘤细胞生存率越低;在场强一样时,脉冲次数越多,生存率也会逐步降低。并且在动物试验中,对照组荷瘤小鼠平均生存时间为26天,最长生存时间为35天;单独IRE治疗组平均生存时间为52天,最长生存时间70天;联合治疗组平均生存时间为85天,最长生存时间为104天,表明联合治疗能显著延长荷瘤小鼠的生存时间。GC能与经过IRE处理过细胞的优先结合,并且膜联蛋白V能够阻碍这种现象。最后,相比于单独治疗组,联合治疗能让线粒体膜电位下降更显著。2、不可逆电杀伤联合GC对小鼠胰腺癌的免疫调节作用:相比于对照组,实验组能够不同程度的提高肿瘤组织内的CD4+T细胞、CD8+T细胞的数量,提高肿瘤组织内CD31的表达;降低肿瘤组织内PD-1、LAG-3的表达,肿瘤增殖指数、成纤维细胞及Treg细胞数量也降低,并且联合治疗效果更显著。另外,联合治疗组在淋巴结中提高了记忆性T细胞数量,在肿瘤组织内提高了效应性T细胞数量。结论在本研究的电参数下,不可逆电杀伤可以明显产生杀死肿瘤细胞的作用,联合GC可产生协同治疗效果,表现在不可逆电杀伤联合GC通过上调T淋巴细胞的数量,降低免疫抑制细胞数量,增强全身抗肿瘤免疫,降低了Ki-67及FAP-α重塑了肿瘤微环境。并且,联合治疗促进线粒体GSK1120212使用方法损伤以及推测GC可能是通过膜结构的修复来促进肿瘤细胞死亡。