肿瘤性疾病是全球范围内的重大公共卫生问题,其不仅是威胁人类健康的重要疾病,而且对动物健康也造成极大的危害。在全球大多数国家,肿瘤已经位列犬、猫死亡原因的首位。犬自发形成的肿瘤与人的大多数恶性肿瘤(如肺癌、乳腺癌HDAC抑制剂、骨肉瘤、黑色素瘤)在肿瘤病理组织形态、肿瘤遗传学以及对药物治疗的反应等方面具有很多相似的特点,以“动物模式”研究人类肿瘤生成、致病机制及防治技术正逐渐被人们重视。因此,开展抗肿瘤药物筛选及相关的机制的研究在宠物临床与医学临床中均具有重要意义。溶瘤病毒(Oncolytic virus,OV)作为一种新型的抗肿瘤方案,已受到广泛的关注。传统观点认为,OV可诱导肿瘤发生凋亡,但细胞凋亡时的“免疫静息”状态理论,与OV可触发较为强烈的抗肿瘤炎症反应现象相矛盾,这是该领域尚未阐明的科学问题。本研究以具有溶瘤特性的羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)为研究对象,开展了ORFV抗肿瘤机制的研究工作。本研究首先构建荷瘤小鼠模型,并以ORFV进行瘤内治疗,发现ORFV可显著抑制肿瘤生长。肿瘤组织冰冻切片显示,ORFV的瘤内注射可以显著提高瘤内坏死性肿瘤细胞的数量、促炎因子表达水平及细胞焦亡相关基因的转录水平。不仅如此,ORFV感染可诱导肿瘤细胞出现质膜肿胀、LDH/HMGB1等炎性内容物释放、Annexin V/7-AAD双阳性染色等细胞焦亡标志性表型。上述结果表明,ORFV可抑制肿瘤生长、诱导肿瘤组织及细胞发生促炎性的焦亡。进一步研究发现,ORFV感染肿瘤细胞、荷瘤小鼠肿瘤组织、临床肿瘤样本后能够激活caspase-3/GSDME信号通路。对肿瘤中Gsdme进行敲除使得ORFV感染后的肿瘤细胞从焦亡转变成凋亡,证实GSDME是ORFV触发肿瘤细胞焦亡的关键性因子。据报道,GSDME在多数肿瘤细胞中表达量较低,甚至不表达。为进一步探究ORFV对此类肿瘤的杀伤、抑制效果,以低表达GSDME的肿瘤细胞小鼠乳腺癌细胞(4T1)、小鼠黑色素瘤细胞(B16)、人类非小细胞肺癌细胞(A549)为研究对象,进行ORFV的溶瘤性研究。结果表明,ORFV也可触发GSDME低表达肿瘤细胞发生焦亡。对经ORFV感染的肿瘤细胞进行检测,发现ORFV不会显著提高细胞中Gsdme的转录水平。然而,ORFV的感染初期可显著上调GSDME的蛋白水平。随后发现,ORFV在感染初期能够通过降低GSDME的泛素化水平“预稳定”GSDME蛋白,随后在其复制进程中触发GSDME的切割、活化及细胞焦亡。随后,本研究进一步探索ORFV触发的肿瘤细胞焦亡对肿瘤免疫微环境的影响。研究发现,ORFV可向瘤内募集肿瘤特异性CD8~+T细胞和细胞毒性T淋巴细胞。对肿瘤Gsdme进行敲除可显著抑制ORFV诱导的瘤内细胞焦亡及淋巴细胞浸润。随后发现,将小鼠体内CD8~+T细胞进行功能性阻断后,ORFV对肿瘤抑制能力也随之被削弱。上述结果表明,ORFV可通过诱导GSDME介导的肿瘤细胞焦亡激活功能性T细胞执行的肿瘤杀伤。免疫组化结果显示,ORFV可诱导PD-1阳性的T细胞浸润至肿瘤内部。提示,ORFV可将免疫“冷”肿瘤转变成“热”肿瘤,进而改善肿瘤免疫微环境。随后采用免疫检查点阻断疗法联合ORFV进行协同治疗,发现免疫检查点阻断疗法可显著增强ORFV的抑瘤效果、延长小鼠生存时间。不仅如此,叠加具有细胞焦亡诱导能力的化药Etoposide也可进一步增强抑瘤效果。上述结果表明,ORFV与免疫检查点阻断疗法及化药疗法联合使用具有更强的肿瘤治疗效果。对ORFV进行毒力基因缺失改造可以显著降低其潜在致病性,赋予ORFV良好的生物安全性。本研究进一步通过对野生型ORFV进行毒力基因缺失,构建临床可接受的ORFV重组毒株ORFV△120及ORFV△120-121,并对其靶向性、杀伤性进行可视化检测。结果显示,重组型ORFV可在体内外触发肿瘤细胞焦亡。其中,通过静脉进行系统性递送的重组型ORFV可以在肺部转移肿瘤中靶向富集,并抑制转移灶的发展。综上所述,本研究证明了ORFV能够抑制肿瘤生长,触发肿瘤组织和细Pevonedistat研究购买胞发生以细胞膜破裂为主Scabiosa comosa Fisch ex Roem et Schult要特征的炎性细胞死亡-细胞焦亡。并发现ORFV通过抑制GSDME的泛素化,增强肿瘤细胞中的GSDME蛋白水平,进而触发依赖于GSDME的肿瘤细胞焦亡。同时,GSDME也是ORFV募集、活化杀伤性T淋巴细胞,激活抗肿瘤免疫的重要因素。ORFV改善了肿瘤免疫微环境使免疫“冷”肿瘤变“热”,并联合免疫检查点阻断或化药疗法产生了更强的抗肿瘤效应。体内试验也进一步证明了ORFV的靶向性,ORFV能够在肿瘤组织内靶向富集,诱导肿瘤组织细胞焦亡,并抑制肿瘤的生长与转移。本研究成果不仅有助于揭示溶瘤病毒的抗肿瘤机制,而且可为开发抗肿瘤药物和通用型肿瘤疫苗这一前沿生物技术奠定理论基础。