研究背景:骨生物材料的植入是目前修复颌面骨缺损最有效的治疗手段之一。随着对骨免疫学研究的深入,近年来发现巨噬细胞在材料诱导下所发生的极化状态影响着后续的成骨效果,简单来说,M1型巨噬细胞可分泌促炎因子导致慢性炎症的发生,造成骨修复效果不佳,然而,M2型巨噬细胞通过分泌抑炎因子为骨修复提供了良好的免疫微环境,对新骨形成发挥积极作用。因此,设计既能直接调控成骨,同时又具备调节局部免疫应答功能的新型骨修复生物材料是目前研究的热点。聚乙交酯-己内酯(Poly(glycolide-co-caprolactone),PGCL)是一种具有良好降解性和生物相容性的高分子材料,纳米羟基磷灰石(n-HA)是一种与骨矿化物化学和结构特性相似的的无机物。因此,PGCL和n-HA复合材料常被用来当作骨充填材料和药物载体,但这些体外无细胞毒性的生物材料在植入到体内时仍会导致早期的炎性反应,如单核细胞浸润,纤维囊形成等,所以赋予其调节免疫微环境的功能至关重要。近年来,槲皮素(Quercetin,Que)由于具有促成骨、抗氧化、免疫调节等多种生理调节功能,引起生物材料研发领域的广泛关注。它是一种植物界的黄酮醇类化合物,有研究表明,它可以通过抑制炎性因子的分泌,减轻炎症对细胞带来的负面影响,此外,还可直接调控干细胞的增殖、凋亡和分化。因此,我们推测槲皮素在骨缺损区域也可能发挥其对免疫和成骨的调节作用,将其负载入n-HA/PGCL材料中,可作为骨充填材料进行骨缺损的修复。但是由于槲皮素具有稳定性差、溶解度低的缺点,使其不能有效发挥功效,从而限制了临床应用。因此,如何实现槲皮素的高效负载和长效释放,使其贯穿早期免疫及后期成骨的整个修复过程,也成为关键所在。综上所述,本研究首先采用气流剪切法制备了槲皮素/纳米羟基磷灰石/聚乙交酯-己内酯(Que/n-HA/PGCL)纳米复合微球,并对其进行了物理化学表征、药物动力学检测及降解性能评估,之后进行了体内外生物相容性评价、免疫调节及成骨效果评估,最后,探讨了该材料在骨修复过程中的生物学机制。研究方法:1.采用气流剪切法制备不同槲皮素含量(质量比分别为0.5 wt%、1 wt%、2 wt%、4 wt%)的Que/n-HA/PGCL纳米复合微球,并采用FT-IR、XRD、SEM等检测微球的物理化学表征,通过紫外吸光度法检测微球包封率、载药率以及药物释放曲线,通过电镜观察、质量称重、组织切片等检测微球降解性能。2.以巨噬细胞RAW264.7和骨髓间充质干细胞BMSCs为细胞模型,建立Que/nHA/PGCL纳米复合微球免疫调节和成骨分化的体外细胞模型体系,采用细胞活死染色、细胞骨架染色、CCK-8、RT-q PCR、Western-Blot、免疫荧光染色、碱性磷酸酶及茜素红染色及定量等方法评估微球的生物相容性、免疫调节以及成骨分化能力。3.采用大鼠颅骨临界骨缺损模型,建立Que/n-HA/PGCL纳米复合微球免疫调节及骨缺损修复的体内动物模型体系,通过Micro-CT三维重建及定量分析、免疫荧光染色、HE染色、Masson染色以及Sirius red染色评估体内免疫调节及骨修复效果,通过重要脏器的HE染色评估微球的体内安全性。4.采用RNA-seq技术对n-HA/PGCL纳米复合微球和Que/n-HA/PGCL纳米复合微球调控成骨的差异基因和信号通路进行富集分析以探讨相关成骨机理。研究结果:1.所制备的微球表面形貌呈“眼球状”,一侧光滑致密,一侧含有微孔,且微球外部为致密壳层,内部为疏松多孔结构,可有效负载Que,包封率达80%左右,0.5wt%、1 wt%、2 wt%、4 wt%Que/n-HA/PGCL组的载药率依次为0.35%、0.84%、1.63%和3.13%。药物释放浓度随载药率的增加而增加,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球在20天降解后药物释放百分比依次为45.7%、47.7%、43.3%和29.5%,具有长效缓释的特点,满足药物释放贯穿整个骨修复过程的要求。2.各组Que/n-HA/PGCL纳米复合微球生物相容性良好。Que/n-HA/PGCL纳米复合微球可促进巨噬细胞RAW264.7向M2型极化,下调促炎基因TNF-α和i NOS表达,上调抑炎基因Arg-1和IL-10表达,降低i NOS蛋白表达,上调Arg-1蛋白表达。在Transwell细胞共培养系统中,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球组通过调控巨噬细胞RAW264.7极化间接促进了骨髓间充质干细胞BMSCs的成骨分化,增加了碱性磷酸酶的表达和钙结节沉积。此外,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球还直接促diABZI STING agonist体外进了骨髓间充质干细胞BMSCs的成骨分化,增加了碱性磷酸酶的表达和钙结节3-Methyladenine MW沉积,上调了成骨相关基因和蛋白的表达(Runx2、ALP、OPN、OCN)。3.在体内大鼠颅骨临界骨缺损模型中,Micro-CT显示,相比于n-HA/PGCL纳米复合微球,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球取得了更好的骨修复效果,4 wt%Que/nHA/PGCL组的效果最佳,7天的组织免疫荧光染色显示,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球上调了骨缺损区Arg-1蛋白表达,下调了i NOS蛋白表达,8周的组织切片HE、Masson、Sirius red染色显示Que/n-HA/PGCL纳米复合微球周围有着更多的新生骨组织,具有更强的骨修复能力。4.RNA-seq测序分析表明Que/n-HA/PGCL纳米复合微球直接调控BMSCs成骨细胞行为的主要通路可能是PI3k-Akt通路和MAPK通路,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球通过调控免疫微环境间接调控BMSCs成骨细胞行为的主要通路可能是PI3k-Akt通路、Ras/MAPK通路和TGF-β/Smads通路。研究结论:1.气流剪切法制备的微球具有“眼球状”表面形貌,可有效地将Que负载到微球中,且具有长效缓释的效果,可在骨修复整个阶段发挥作用。2.在早期炎症期,Que/n-HA/PGCL纳米复合微球可以通过促进巨噬细胞向M2型极化,构建一个有利于成骨的免疫微环境,在后期成骨期,通过直接和间接促进骨髓间充质干细胞成骨分化达到协Disease pathology同促进骨修复的效果。3.Que/n-HA/PGCL纳米复合微球可在骨再生不同阶段通过调控骨髓间充质干细胞BMSCs成骨相关的基因及信号通路,达到直接或通过调控免疫微环境间接促进骨髓间充质干细胞BMSCs成骨分化的效果,为其更好地应用于骨组织工程领域提供了一定的理论基础。