冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞,造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病,常常被称为“冠心病”。目前该疾病位于我国各类心脏病中发病率之首,并仍然呈现上升趋势。中医治病遵从辨证论治思想,如张仲景在《金匮要略》中提出“胸痹而痛”,又如《黄帝内经·灵枢》里记载“手少阴气绝则脉不通,脉不通则血不流”,认为血瘀证为冠心病的基本证型,现今临床上以气虚血瘀证多见。本实验应用睡眠剥夺方法持续6周形成大鼠气虚血瘀证,后行大鼠心脏冠脉左前降支结扎术构建大鼠冠心病气虚血瘀证病证结合模型。在此基础上首先研究了冠心病气虚血瘀证模型大鼠的血小板功能及形态学改变,此外给予不同剂量补阳还五汤,观察补阳还五汤通过改善血小板功能保护冠心病气虚血瘀证大鼠的药理作用,应用网络药理学的方法预测补阳还五汤治疗血小板疾病的可能作用靶点及相关机制,并对其提示的GPVI蛋白及其下游通路进行验证研究,为治疗冠心病气虚血瘀证及抗血小板药物靶点提供新的研究思路和临床应用依据。本研究分为五个部分:一、冠心病气虚血瘀证模型大鼠血小板功能改变的研究目的探究冠心病气虚血瘀证模型大鼠血小板功能变化。方法SD大鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组。大鼠不规则睡眠剥夺6周形成大鼠气虚血瘀证后,行大鼠心脏冠脉左前降支结扎术构建大鼠冠心病气虚血瘀病证结合模型,术后48 h处死动物,流式细胞术测定大鼠血小板膜糖蛋白CD62p表达量、电阻法测定ADP、COL诱导的血小板聚集率、大鼠血清5-HT、TXA2含量,大鼠血小板COX-1含量、ATP释放量。结果1.与正常组相比,模型组大鼠活化血小板比率以及CD62p表达量中位数都显著上升(P<0.01),ADP、COL诱导的血小板MAR、AAR均明显升高(P<0.01),血清5-HT、TXA2均明显升高(P<0.01),血小板中COX-1含量明显升高(P<0.01),血小板ATP释放量明显上升(P<0.01)。2.与模型组相比,阿司匹林可以明显降低活化血小板比率、CD62p表达量中位数(P<0.01或P<0.05),显著降低由ADP、COL诱导的大鼠血小板MAR和AAR(P<0.01或P<0.05),显著降低大鼠血清中5-HT、TXA2水平(P<0.01),显著降低大鼠血小板中COX-1含量及ATP释放量(P<0.01)。小结冠心病气虚血瘀大鼠发生血小板过度活化、聚集,膜糖蛋白CD62p表达量显著上升,活化血小板数量及活化程度上升;ADP、COL两种诱导剂条件下的血小板聚集率显著上升,提示血小板功能紊乱,易加速血栓形成。大鼠血小板脱颗粒现象异常,血小板中COX-1含量上升、ATP释放量增加,血清中TXA2、5-HT含量显著上升,脱颗粒现象会进一步扩大血小板活化比率,更多的血小板将附着在损伤部位,聚集并形成血栓凝块。二、冠心病气虚血瘀证模型大鼠血小板及相关功能的形态学研究目的探究冠心病气虚血瘀证模型对大鼠血小板的形态学影响。方法SD大鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组。造模方法同前,术后48h处死动物,利用扫描电镜观察大鼠血小板超微结构和大鼠冠状动脉内壁血栓形成情况,利用荧光酶标仪对血小板内Ca2+浓度进行检测,利用荧光显微镜观察大鼠血小板Ca2+表达荧光强度,利用HE染色、Masson三色染色技术观察大鼠心肌组织形态。结果1.与正常组相比,模型组大鼠血小板超微结构显示其伪足伸出现象多发,血小板之间相互联结,视野多见成片血栓团块;大鼠冠状动脉内壁有许多黏性“胶状物”,并有较多的血小板、红细胞附着于冠脉内壁之上;血小板内荧光钙离子浓度显著升高(P<https://www.selleck.cn/products/ly2157299.html0.01);HE染色多见心肌组织以瘢痕组织较多,多见心肌细胞消失,炎性细胞增多;Masson染色多见心肌纤维化区域面积较大,心肌细胞多被割裂,被纤维组织取代。2.与模型组相比,阿司匹林可以有效降低大鼠血小板聚集成团的现象,但对伪足伸出改善不太明显;改善大鼠冠状动脉内壁,少见血栓团块,偶见红细胞附着;明显降低血小板内荧光钙离子浓度(P<0.05);HE染色可见确认细节心肌细胞坏死面积减少,心肌细胞排列较完整,炎性细胞减少;Masson染色可见心肌纤维化区域明显减少,外侧心肌细胞排列整齐,心肌组织较厚。小结冠心病气虚血瘀证大鼠冠状动脉内壁不光滑,血管受损,导致血小板内部Ca2+浓度升高,血小板超微结构显示其过度活化、聚集,促进血小板功能紊乱,加速血栓形成。同时,该模型也会导致大鼠心肌组织受损严重,心脏功能受损,纤维化严重,进而促进心衰的发生。三、冠心病气虚血瘀证大鼠证候和相关指标变化及补阳还五汤Anaerobic membrane bioreactor的干预作用研究目的探究补阳还五汤通过改善血小板功能治疗大鼠冠心病气虚血瘀证的药效学作用。方法SD大鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组、补阳还五汤6g/kg组、补阳还五汤13g/kg组。造模方法同前,术后以1mL/100g剂量灌胃给药14天。检测中医证候指标:舌象、脉象、抓力;西医凝血功能、心功能指标:凝血四项(APTT、PT、TT、FIB)、血液流变学、超声心动图、心肌缺血面积、心肌损伤标志物(CK、CK-MB、LDH)以及心肌病理染色(HE、Masson);血小板功能评价指标:CD62p表达量、血小板聚集率(ADP、COL)、钙离子表达量、扫描电镜观察血小板超微结构以及冠状动脉超微结构等指标。结果1.与正常组相比,模型组大鼠脉搏幅度明显降低(P<0.01),舌面舌底R、G值均显著性降低(P<0.01),最大抓力值明显下降(P<0.01),全血黏度在低切、中切、高切剪应力作用下均显著升高(P<0.01),血浆黏度也有显著上升(P<0.01),活化部分凝血酶时间(APTT)显著延长(P<0.01),凝血酶原时间(PT)有缩短趋势(P<0.01),纤维蛋白原(FIB)数值显著升高(P<0.01),超声心动图显示LVAWs、LVAWd、CO、EF、FS 均显著降低(P<0.01),LVIDSs、LVIDd、LVVs和LVVd均显著升高(P<0.01);大鼠心肌缺血面积显著增加(P<0.01):血清CK、LDH及CK-MB活性明显升高(P<0.01);HE染色结果显示,大鼠坏死区面积大,炎性细胞增多,坏死区以瘢痕组织为主,Masson染色结果显示心肌纤维化严重,心肌细胞排列错乱:ADP、COL诱导的血小板聚集率均明显上升(P<0.01),活化血小板比率以及CD62p表达量中位数都显著上升(P<0.01),钙离子表达量上升(P<0.01),血小板超微结构显示模型组大鼠血小板伪足相互交错,聚集情况明显,冠脉内壁凹凸不平,有较多血栓团块附着。2.与模型组相比,补阳还五汤各剂量组大鼠脉搏幅度明显升高(P<0.01),脉象呈现流动性更好,有效改善大鼠舌底R、G值以及舌面R值(P<0.01),且补阳还五汤6g/kg可显著改善大鼠舌面R、G值(P<0.01),补阳还五汤13 g/kg可明显改善大鼠舌面R、B值(P<0.01);各剂量组均可明显改善大鼠最大抓力值指标(P<0.05或P<0.01),全血黏度指标在低切(5s-1)、中切(60s-1)、高切(150s-1)剪应力作用下均有显著下降趋势(P<0.01或P<0.05),各剂量组大鼠的血浆粘度指标(100s-1)也有明显下降趋势(P<0.01或P<0.05),补阳还五汤6 g/kg组大鼠APTT延长(P<0.01),具有显著统计学差异;补阳还五汤13 g/kg组大鼠APTT指标明显延长(P<0.01),FIB指标显著降低(P<0.01),超声心动图结果显示大鼠 LVAWs、LVAWd、LVPWs、CO、EF、FS 显著升高(P<0.01 或 P<0.05),LVIDSs、LVIDd、LVVs和LVVd显著降低(P<0.01),补阳还五汤13 g/kg还可以显著升高LVPWd(P<0.01);补阳还五汤各剂量均能有效减少大鼠心肌梗死面积(P<0.05),大鼠血清CK、LDH及CK-MB活性均显著降低(P<0.05或P<0.01);HE结果显示补阳还五汤各剂量可以减少心肌坏死区域面积,减少炎性细胞浸润,增厚外侧心肌组织,保护心功能;Masson染色结果显示大鼠心肌纤维化区域明显减少,外侧心肌排列整齐、致密;显著降低由ADP、COL诱导的血小板聚集率(P<0.01或P<0.05),显著降低CD62p表达量中位数及活化血小板比率(P<0.01或P<0.05),降低血小板内荧光钙离子浓度(P<0.01或P<0.05),血小板超微结构显示补阳还五汤各剂量可减少大鼠血小板伪足伸出,聚集减少,冠脉内壁血小板附着减少,内壁较平滑。小结本部分研究通过睡眠剥夺复合大鼠冠脉左前降支结扎术构建冠心病气虚血瘀证病证结合动物模型,通过中医证候指标:舌象、脉象、抓力;以及西医血液、心功能检测指标:凝血四项、血液流变学、超声心动图、心肌缺血面积、心肌损伤标志物以及心肌病理染色等;血小板功能评价指标:CD62p表达量、血小板聚集率、钙离子表达量、血小板超微结构、冠状动脉超微结构等,来探讨补阳还五汤通过改善血小板相关功能,达到治疗冠心病气虚血瘀证大鼠的药效学保护作用。其作用与增加大鼠脉搏幅度、抓力,改善舌象,延长APTT、PT,降低FIB含量,降低全血及血浆黏度,增加EF、FS、CO改善心功能,增加LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd,降低LVIDs、LVIDd、LVVs及LVVd抑制心室重构,减少心肌梗死面积,减少钙离子表达量,减少血小板膜糖蛋白CD62p表达量,降低ADP、COL诱导血小板聚集率等实验结果。综合各项指标比较,发现补阳还五汤13 g/kg对大鼠冠心病气虚血瘀证模型有较好保护作用。四、基于网络药理学方法预测补阳还五汤入血成分治疗血小板疾病的通路研究目的通过网络药理学方法探究补阳还五汤治疗血小板疾病的潜在靶点和机制。方法实验室前期工作采用LC-MS/MS技术和方法,得到13个补阳还五汤入血成分信息。通过PharmMapper软件、TCMSP数据库、ETCM数据库以及BATMAN数据库和Pubchem数据库,得到补阳还五汤药物靶点信息;通过CTD数据库、Gene Cards数据库获取血小板疾病靶点;通过Bioinformatics&Evolutionary Genomics、GENEMANIA、STRING、KEGG等平台预测补阳还五汤治疗血小板疾病的作用靶点。结果补阳还五汤可能通过对蛋白质结合、信号受体结合、血红素结合、相同蛋白结合、酶结合等生物过程发挥治疗血小板疾病的作用;其作用机制可能与流体剪切应力和动脉粥样硬化途径、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、白介素17信号通路、HIF信号通路、血小板激活信号通路、PI3K/AKT信号通路等信号通路有关。小结补阳还五汤通过多成分、多靶点、多通路协同作用的方式治疗血小板疾病,其中对于血小板激活信号通路以及流体剪切应力和动脉粥样硬化途径以及膜蛋白受体GPVI表达量可能为关键机制之一,后续实验将对此进行更深入的验证与探讨。五、基于GPVI及其下游通路探讨冠心病气虚血瘀证引起大鼠血小板改变及补阳还五汤干预作用的机制目的:探究补阳还五汤调控血小板GPVI减少血小板活化保护冠心病气虚血瘀证大鼠的作用机制。方法:SD大鼠随机分为正常组、模型组、阿司匹林组、补阳还五汤6 g/kg组、补阳还五汤13 g/kg组。造模、给药方法同前,Elisa方法检测大鼠血清中5-HT、TXA2、sGPV1 水平,血小板内 COX-1 含量、ATP 释放量,Western Blot 检测 GPVI、Syk、IP3及CALDAG-GEFI蛋白表达量,PLCγ2磷酸化程度。结果:1、与正常组相比,模型组大鼠血清TXA2、5-HT均明显升高(P<0.01),配平后血小板中COX-1含量明显升高(P<0.01),GPVI表达量明显上升(P<0.01)且血清中sGPVI含量明显上升(P<0.01),Syk、IP3及CALDAG-GEFI表达量明显上升(P<0.01),PLCγ2磷酸化程度明显上升(P<0.01)。2、与模型组相比,补阳还五汤各剂量均可显著降低大鼠血清中TXA2、5-HT水平(P<0.05或P<0.01),显著降低大鼠血小板中COX-1含量(P<0.01),显著降低大鼠血小板膜糖蛋白GPVI表达量(P<0.01或P<0.05)且显著降低大鼠血清中sGPVI含量(P<0.01或P<0.05),显著降低大鼠血小板蛋白Syk、CALDAG-GEFI表达量(P<0.01),补阳还五汤13 g/kg可显著降低IP3表达量(P<0.05),显著降低大鼠血小板蛋白PLCγ2磷酸化程度(P<0.05)。小结:本部分研究在前期药效学和网络药理学预测结果的基础上,进一步探讨补阳还五汤改善血小板功能保护冠心病气虚血瘀证的作用机制(如图1)。实验表明,补阳还五汤既可调控降低血小板膜糖蛋白GPVI表达量并减少血清中sGPVI含量,同时降低该蛋白下游通路中Syk、IP3、CalDAG-GEFI的表达量及PLCγ2磷酸化程度,有效抑制胶原介导的血小板活化程度;还可以通过减少大鼠血清中5-TH、TXA2含量,减少大鼠血小板中COX-1含量、ATP释放量,有效抑制血小板脱颗粒反应,减少血小板进一步活化反应的发生。这些作用机制与第四部分网络药理学预测结果有较好的一致性,说明益气活血中药补阳还五汤可能会从调控血小板膜糖蛋白GPVI方面发挥改善大鼠冠心病气虚血瘀证的作用。