鲫鱼(Carassius auratus)作为我国主要的淡水鱼类之一,在我国有着悠久的养殖及食用历史,是居民餐桌Hepatitis B chronic上常见的食用鱼。不同于“四大家鱼”,鲫鱼体型较小,其肉质鲜美,从古至今深受国人喜爱。近几年,一种名为鲫鱼疱疹病毒(Carassius auratus herpesvirus,CaHV)的病毒性疾病在国内蔓延,给我国鲫鱼养殖业带来毁灭性影响,并造成了巨大的经济损失。先前一些研究表明,鲫鱼疱疹病毒病具有传染快速、死亡率高的特点,是鲫鱼致命的病毒性疾病。因此,如何迅速、及时的发现病毒感染是保证养殖质量、降低损失亟需解决的关键问题。本研究致力于解决鱼类疱疹病毒(CaHV)的早期感染鉴定及病毒感染检测方法的研究,描述了四种检测方法,包括:(1)简单、准确鉴定CaHV感染的多聚酶链式反应方法(PCR,polymerase chain reaction);(2)能够相对定量检测CaHV病毒拷贝数的荧光定量PCR技术(q PCR,quantitative real-time PCR);(3)能够绝对定量病毒拷贝数的微滴式数字PCR方法(ddPCR,dropletdigital PCR);(4)快速简单的重组酶辅助扩增(RAA)检测与横向流动试纸(LFselleckchem DocetaxelD)结合的可视化方法(RAA-LFD,recombinase-aid amplification assay coupled with lateral flD-Lin-MC3-DMA溶解度ow dipstick)。并就以上方法的灵敏性、特异性、重复性和临床样品检测等方面做了比较。通过构建含CaHV-TNFR(肿瘤坏死因子受体,tumor necrosis factor receptor)目的基因的重组质粒,以该重组质粒为模板,测试了四种方法的敏感性及特异性。结果表明,与普通PCR技术相比,q PCR具有高的灵敏性及检测限度,RAA-LFD检测方法灵敏度优于普通PCR,但低于RT-q PCR;本文中PCRAGE检测方法,在原有双重PCR检测基础上进行改进,仅需一对引物进行PCR反应,便可判断出是否存在CaHV感染。该方法简单、准确,能够特异性区分2型鲤疱疹病毒(Cy HV-2,cyprinid herpesvirus-2),并且能够检测10000个拷贝的病毒拷贝数。应用于本研究的实时荧光定量PCR诊断方法,通过构建标准质粒来建立标准曲线,能够检测出10拷贝的含CaHV特异性基因的重组质粒。ddPCR作为绝对定量方法,在本研究中能够检测单个拷贝的病毒量,除了传统的分子生物学检测技术的应用,本研究还描述了一种新型、快速、简单的重组酶辅助扩增(RAA)技术,结合横向流动试纸(LFD)实现了反应结果的直观可视化,可在40℃条件下,在35min内实现对CaHV肿瘤坏死因子受体(TNFR)的敏感诊断。我们的RAA-LFD方法每次反应的检测限为100个病毒拷贝数,比传统PCR检测方法的灵敏度高100倍。结果表明,RAA-LFD法作为CaHV实时检测(POCT)的替代方法是可行的,在水生动物疾病防治中具有一定的应用价值。本文开发的4种方法均具有高的特异性及稳定性,所使用的其他病毒病原体,包括锦鲤疱疹病毒(KHV),鲤鱼疱疹病毒2型(Cy HV-2),传染性造血坏死病毒(IHNV),春季鲤病毒血症(SVCV)和草鱼呼肠弧病毒(GCRV)均无交叉反应出现。结果表明,应用于本研究中的这四种方法可实现对目的基因CaHVTNFR的敏感诊断。另外,本文通过对鲫鱼进行腹腔注射CaHV病毒原液,使用一次性咽拭子无创采样的方法获得了连续样本,用于临床试验样本检测,减少了外力器械对鱼体的损伤及影响。在此研究中,还采用滤纸法快速获取DNA,在一定程度上减少了成本支出。为了研究的准确性,本文在临床样品检测环节中加入对实验组死亡鱼头肾DNA样本获取步骤,并采用建立的4种检测方法进行检测。总之,本研究期望能为CaHV的快速检测提供借鉴,并为CaHV的早期检测试剂盒的研发提供思路。