小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)是一种由大多数类型细胞分泌的纳米级囊泡(30-200 nm),大量存在于唾液、精液、血液、脑脊液和尿液等体液中。它通过将信息分子(例如核酸和蛋白质)从供体细胞输送到受体来促进细胞间通讯。近年来,具有高稳定性、高特异性、携带信息丰富且易于从体液中获得的sEVs成为了最受关注的疾病标志物之一,在疾病诊断和术后监测中发挥重要作用。在疾病的发生阶段,sEVs上相关生物标志物丰度非常低,给sEVs的检测带来了很大的困难。因此,需要采用信号放大策略来提高sEVs检测的灵敏度。其中,基于核酸的信号放大,因其可编程、合成简单、生物相容性高、信号放大效果好等优点,成为了最广泛使用的策略之一。核酸信号放大策略按反应动力学可以分为线性和指数核酸信号放大。引物交换反应(primer exchange reaction,PER)和催化发夹组装(catalytic hairpin assembly,CHA)可编程、设计灵活、操作简便,信号放大效果好。immunoelectron microscopy将这两个策略单独使用,或级联产生指数级的信号放大,可以实现sEVs表面蛋白的灵敏检测。基于sEVs检测的疾病诊断和治疗,需要满足对sEVs进行高特异性和高准确度识别的需求。但是,体液基质成分复杂、sEVs表面蛋白存在表型异质性,因此对单种标志物检测,往往存在准确性不足的问题。DNA生物逻辑门依赖于碱基互补配对原则,可以将多种生物信号特异、准确地传入生物电路,按用户需求输出一个布尔运算后的信号,可以有效避免“假阳性”或“假阴性”。基于此,本文确认细节设计了两种基于聚合酶驱动的信号放大策略,通过对sEVs表面多种蛋白的生物信号进行逻辑分析并产生线性或指数级的荧光信号放大。这些方法将应用于乳腺细胞系来源sEVs的母细胞区分和乳腺癌(breast cancer,BC)鉴定。具体研究内容如下:第一章绪论本章主要对sEVs的概念、分类、组成、功能、分离与富集以及在液体活检中的应用进行了概述。同时,介绍了目前常用的核酸信号放大策略和DNA生物逻辑门以及在sEVs检测中的应用。最后,阐述了本论文的研究意义与内容Colforsin分子量。第二章聚合酶驱动的逻辑信号放大方法用于sEVs表面蛋白检测和BC鉴定在本章中,开发了聚合酶驱动的逻辑信号放大系统(PLSAS),可以同时检测sEVs上两种表面蛋白以及BC的鉴定。该策略以肿瘤来源sEVs上富含的粘蛋白 1(Mucin 1,MUC1)和上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)作为信号输入,用PER进行逻辑运算和信号放大,输出荧光信号。我们构建了两种生物计算模块,包括或(OR)逻辑门和与(AND)逻辑门。其中,OR逻辑门以MUC1或EpCAM蛋白作为单一信号输入时,sEVs的检测极限分别为24颗粒/μL和58颗粒/μL。而AND逻辑门对BC患者有更高的区分度,对BC阳性样本和健康人的血清检测接收者操作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析的曲线下面积(area under the curve,AUC)为 0.981。第三章聚合酶驱动的指数级信号放大用于sEVs表面多种蛋白同时检测和BC鉴定在上一章的基础上,我们设计了一种由聚合酶驱动的能自发实现PER和CHA自催化的引物循环(primer catalyzed cycle,PCC)体系并实现了 sEVs上两种蛋白的AND逻辑门检测。该策略靶向BC患者sEVs表面高表达的EpCAM蛋白和人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2),经过AND逻辑计算后输出信号。在PCC信号放大器中,仅通过四个发夹使PER引物P和CHA触发器T循环再生,实现指数信号放大。PCC大大增加了检测灵敏度,将sEVs的检测限降低至8颗粒/μL,对BC阳性患者ROC分析的AUC提升至0.992,并实现了早期和晚期BC患者的区分。