研究目的:红细胞是人体内数量最多的血细胞,也是最早出现的血细胞之一。前期对于人类红细胞发育等层面的研究多聚焦于成体,而对于人体胚胎发育早期红细胞的分子特征知之甚少。传统观点认为,红细胞是一种具有专性携氧功能的血细胞。不过也有研究数据表明,红细胞兼具了免疫调控的功能,特别是在机体处于感染或者肿瘤等应激状态下。然而,这种免疫调控功能是所有红细胞均具有,还是仅存在于部分红细胞群体仍不清晰。此外,对于具有免疫调控功能的红细胞的分子特征尚不明确。本研究通过收集贯穿人体多个发育位点(卵黄囊、胎肝、早产及足月儿脐带血和成体骨髓)的有核红细胞,并对其进行单细胞维度的研究,揭示了人胚发育早期有核红细胞的独特分子特征,解析了人类有核红细胞的功能异质性,并鉴定和验证了免疫调控红细胞亚群的存在。研究方法:本研究以人类有核红细胞为研究对象,借助流式细胞分选术,收集了来自卵黄囊、胎肝、早产及足月儿脐带血和成体骨髓的有核红细胞,使用10x Genomics和STRT-seq平台完成建库和单细胞转录组测序,后续利用生物信息学的手段对其进行更加深入的下游分析。首先确定了有核红细胞的异质性,解析了各个细胞亚群的特征性基因和生物学通路,构建了有核红细胞分化的路径。随后,在细胞亚群水平,通过对不同发育位点的有核红细胞进行差异分析,揭示了其发育位点特异性。最后,对于免疫调控红细胞亚群,本研究从免疫相关分子通路、特征性基因、转录调控网络等层面进行了分析,并筛选了该亚群的细胞表面标志分子,通过原位多色免疫荧光染色和流式细胞术的方法确定了该细胞群体的存在。此外,通过与经典免疫细胞进行共培养实验,在细胞因子分泌、基因表达和蛋白质表达多个层面对其进行了解析。配体-受体对互作分析还鉴定出免疫调控红细胞与其他经典免疫细胞的互作分子对,并利用原位多色免疫荧光染色对其进行了验证。研究结果:(1)人类有核红细胞存在功能异质性亚群MK-4827作用。将各个发育位点的有核红细胞进行整合分析,从中鉴定出四个特征分明的异质性亚群,包括三个行使经典红细胞功能的亚群和一个具有免疫特征的亚群。同时,尽管比例不同,但四个亚群在不同发育位点均存在。(2)免疫调控红细胞亚群拥有独特的分化路径。拟时序分析和拓扑结构分析发现,免疫调控红细胞拥有不同于经典红细胞的分化路径。经典红细胞的三个亚群距离较近,并且具有Z-VAD-FMK逐渐成熟的分化路径;而免疫调控红细胞存在独特的路径,与经典红细胞呈现出两个分化方向。(3)卵黄囊、胎肝和脐带血来源红细胞的独特分子特征。对来自不同发育位点的有核红细胞各亚群进行平行分析,发现在非成熟阶段,卵黄囊来源的有核红细胞高表达的差异基因多富集在胆固醇合成、有氧糖酵解等通路,胎肝有核红细胞主要富集了蛋白质合成相关通路,而脐带血来源有核红细胞则表现出相对较高的血红蛋白基因的表达;在成熟阶段,卵黄囊来源有核红细胞表现出特异性高表达的金属硫蛋白基因(MT2A,MT1G)和锌转运相关基因(SLC30A,SLC39A),并且兼具了高增殖的特征。(4)免疫调控红细胞兼具红系和免疫双重转录调控网络。转录因子活性分析发现,三群经典红细胞拥有着与各种成熟阶段相对应的转录因子富集,包括分化早期的MYC、GATA1、KLF1,分化末期的NFE2、TAL1等;免疫调控红细胞不仅富集了 MYC、MYB、GATA1等红系相关转录因子,而且还特异性富集到MEF2C、SPI1、FOS、JUN等免疫相关转录因子,这些转录因子的靶基因同样富集到趋化因子信号通路、抗原处理和递呈等免疫相关通路。(5)免疫调控红细胞的鉴定。免疫应答的激活和细胞因子介导的信号通路相关基因和VSIR、TGFB1、TNFSF10在免疫调控红细胞亚群特异性高表达。通过筛选,发现CD63是免疫调控红细胞特异性最强且表达量最高的细胞表面标记分子,来自胎肝和脐带血样本的有核红细胞中也的确存在CD63阳性细胞亚群,比例约占GYPA+CD71+有核红细胞的2.58%和6.36%。原位免疫荧光染色同样发现了GYPA+CD63+细胞的存在,并且在蛋白水平发现这些双阳性细胞高表达HLA-E和TGF-β等。利用流式细胞术分选CD63阳性和CD63阴性红细胞,并将其与外周血单个核细胞进行共培养。相较于CD63阴性组,CD63阳性组CCL4、CXCL8、IFITM3等免疫相关基因表达显著增加,蛋白水平上发现IL-8、IL-6、TNF等在CD63阳性组同样显著增加。此外,将其与CD11b阳性的细胞进行共培养,发现CD63阳性红细胞能够显著促进CD11b阳性细胞TNF的表达。(6)各发育位点免疫调控红细胞的平行比较及其与免疫细胞的互作分析。利用各个发育位点免疫调控红细胞的特征性高表达基因进行相关性分析,发现卵黄囊、胎肝和脐带血来源的免疫调控红细胞距离较近,并且共享的基因数量也较多,而成体骨髓来源的免疫调控红细胞则距离三者较远,共享的基因数量也较少。基于各发育位点免疫调控红细胞的特异性高表达基因进行富集分析,发现卵黄囊免疫调控红细胞主要富集在低氧应答、胚胎器官发育等通路,胎肝免疫调控红细胞主要富集核糖体的生物合成、线粒体翻译等通路,脐带血免疫调Biomedical Research控红细胞则富集在白细胞增殖、抗原加工和递呈等先天性免疫相关通路,而成体骨髓免疫调控红细胞富集的通路则包括淋巴细胞激活、T细胞活化的调控等继发性免疫相关通路。配体-受体对的互作分析结果显示,相对于经典红细胞,免疫调控红细胞与免疫细胞富集到的配体-受体对数量更多,强度更大。原位免疫荧光染色结果也对互作分析的结果进行了验证。在人胎肝切片中,CD63阳性的免疫调控红细胞与CD56阳性的NK细胞通过HLA-E-KLRC1互作,在空间上紧邻;与CD20阳性的B细胞,CD63阳性的免疫调控红细胞则通过MIF-CD74分子对进行互作,在空间位置上两类细胞也相互接触。研究结论:本研究在单细胞维度整合分析了贯穿人体多个发育位点(卵黄囊、胎肝、早产及足月儿脐带血和成体骨髓)的有核红细胞,构建了人类有核红细胞从胚胎到成体的细胞和分子全景图,并对其分子表征和异质性进行了系统分析,为红细胞领域提供了非常有价值的数据资源。此外,体内外红细胞的对比分析还发现人胚胎干细胞分化而来的有核红细胞存在着代谢异常、蛋白质合成不足等缺陷,这些发现可以协助优化体外红细胞生成体系、提高体外体系产生红细胞的效率,为体外批量产生功能性红细胞奠定了理论基础。总之,本研究不仅揭示了人早期胚胎红细胞独特的分子特征和功能异质性,还成功鉴定和验证了免疫调控红细胞亚群的存在,开拓了有核红细胞的新功能研究领域。