由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)感染引起的新型冠状病毒病(Coronavirus disease 2019,COVID-19)在全球已累计报道确诊病例超过6.5亿人次,死亡人数超660万,对人类生命健康和社会经济发展都造成了巨大损失。SARS-CoV-2 已出现很多变种,其中 Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron是发生大范围传播的主要变种。全球目前流行的主要以Omicron(BA.5)、(BA.XXB.1)毒株为主,大多数突变发生在刺突蛋白(Spike,S)上,而核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)基因序列相对较为保守。SARS-CoV-2的N蛋白在病毒的复制中起重要作用,在感染早期患者的血液中即存在高水平的N蛋白。N蛋白具有良好的免疫原性,感染后7d可诱导产生IgM抗体,7 d～14 d可检测到IgG,抗体出现时间早且持续时间长。N蛋白及其特异性抗体,均是SARS-CoV-2感染的重要检测靶标,针对SARS-CoV-2 N蛋白抗体的检测相比S蛋白表现出更高的敏感性。本研究分别利用大肠杆菌系统和哺乳动物系统表达并纯化SARS-CoV-2重组N蛋白,通过B细胞杂交瘤技术筛选adjunctive medication usage制备特异性识别重组N蛋白的单克隆抗体,进一步通过Western blot、间接免疫荧光试验、ELISA分析并筛选与原核、真核表达SARS-CoV-2重组N蛋白的特异性识别能力强的优势单抗,并用于建立基于SARS-CoV-2 N蛋白单抗的竞争ELISA检测方法,初步用于人和不同动物血清学检测,以期为人和不同动物提供高效、快速的血清学检测方法。1.SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以NCBI中SARS-CoV-2N蛋白的全长基因序列(GeneID:43740575)作为模板,对N基因进行PCR扩增,分别连接原核表达载体pET-28a、pGEX-6P-1以及真核表达载体pcDNA3.4,经PCR菌落验证及测序鉴定正确后获得相应重组表达质粒。将2种原核表达质粒分别转化BL21(DE3),得到重组表达菌株BL21(DE3)-pET-28a-N和BL21(DE3)-pGEX-6P-1-N,经IPTG诱导和Ni~(2+)柱亲和层析纯化,获得了大小分别为53 kDa的原核表达重组His-N蛋白及73 kDa的重组GST-N蛋白。将真核表达质粒pcDNA3.4-N转染CHO真核表达细胞,培养上清经Ni~(2+)柱亲和层析纯化获得真核表达的重组CHO-N蛋白。Western blot鉴定结果显示,三种重组蛋白均能与小鼠或人阳性血清反应,表现出大小正确的单一条带,为单克隆抗体的制备和筛选提供了良好的生物材料。经过3次小鼠免疫后利用经典B细胞杂交瘤技术筛选制备特异性识别重组N蛋白的单克隆抗体,共获得12株能够稳定、持续分泌SARS-CoV-2N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为 1E8、4C2、11F4、5D3、8B8、6C5、5E5、5D9、1A2、1C5、1D9、5H9,其细胞上清效价均大于1.0×105。亚类鉴定结果显示,单抗1E8、4C2、11F4、5D3、8B8、1A2、1C5、1D9、5E5 属于 IgG1,单抗 5D9、5H9、6C5 属于 IgG2a。Western blot实验显示,12株单抗均仅与重组N蛋白反应,与空载体无反应。对纯化后的4C2、11F4和1A2单抗的亲和力进行分析,其亲和力常数分别为1.42×10~(10) M~(-1)、4.4×10~8 M~(-1)和1.17×10~9 M~(-1),均属于高亲和力抗体。间接免疫荧光试验以及基于CHO-N蛋白的间接ELISA结果均表明,12株单抗均能特异性结合真核表达的SARS-CoV-2N蛋白,其中4C2、8B8、11F4、1A2、1D9、1C5这6株单抗反应性强。进一步通过ELISA方法分析其中6株特异性较好单抗对不同冠状病毒N蛋白的识别能力,结果表明其均可特异性识别SARS-CoV-2重组N蛋白,具备用于SARS-CoV-2检测的潜能,其中4C2单抗特异性和亲合力相对更强,可用于下一步竞争ELISA方法的建立。2.基于SARS-CoV-2 N蛋白单抗的竞争ELISA方法的建立与应用选择4C2单抗建立SARS-CoV-2N蛋白单抗的竞争ELISA方法。通过棋盘法确定GST-N的最佳包被浓度为1 μg/mL,HRP-4C2酶标抗体的工作浓度为1:12000(99.5ng/mL)。在此基础上,通过控制单一变量法对竞争ELISA的各试验条件进行优化,最终确定检测步骤如下:以CBS稀释GST-N至1μg/mL,4℃包被16h;加入封闭液(含2%脱脂奶的PBS)于37℃封闭3 h;待测血清1:10稀CHIR-99021核磁释,酶标抗体作用时间为1 h;37℃显色8 min,测定OD450。根据60份阴性小鼠血清和60份阳性小鼠血清的检测结果,确定该竞争ELISA方法的阈值为27.36%。对建立的竞争ELISA方法的敏感性、特异性和稳定性等性能进行了分析。结果表明,该方法的检测限为0.106 μg/mL,与包括其它冠状病毒在内的19种病原微生物感染的不同动物阳性血清均无交叉反应,说明方法的特异性良好,批间和批内重复试验结果显示该方法具有良好的重复性。利用建立的竞争ELISA方法对43份人血清样品进行检测,与化学发光免疫分析法相比,该竞争ELISA方法的敏感性为96.15%,特异性为 94.12%,均优于商品化 SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein IgG AntibCell Cycle抑制剂ody ELISA 试剂盒。利用建立的竞争ELISA方法测定412份人血清样品,与化学发光免疫分析法的总符合率为98.78%;对34份猫、40份犬和52份猪血清样品进行检测,结果均为阴性,表明病毒外溢到其他动物的风险较低。本研究通过制备SARS-CoV-2 N蛋白特异性单克隆抗体,建立了基于该单抗的竞争ELISA方法,特异性和敏感性良好,为人与不同动物SARS-CoV-2感染的血清学检测提供了重要技术基础。