狂犬病毒编码5个结构蛋白,包括核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L),是一种不分节段的单股负链RNA病毒。人一旦感染狂犬病毒并出现临床症状,死亡率可达100%。因此,是威胁人类健康的一个重要疾病,这使得针对狂犬病的药物研发变得十分迫切。胞内抗体为重组抗体片段,能在细胞内表达,是免疫治疗新策略之一,它们的基因片段可由载体递送到细胞中进行表达,然后在细胞中与抗原相结合,抑制靶蛋白活性。单链抗体是构成胞内抗体最常用的抗体片段形式,已经有很多的证据表明,胞内抗体具有巨大的临床潜力。因此,本实验构建了抗狂犬病毒N蛋白与G蛋白的胞内抗体及其PROTACs,为了使得胞内抗体及其PROTACs可以在体内长期分泌表达,本试验选择了腺相关病毒作为载体,以期能达到预防狂犬病的目的。第一部分:运用分子克隆技术构建pLVX-Puro-CVS-G重组质粒,转化后将阳性克隆进行DNA测序分析,对测序成功的菌液进行扩培,通过Western Blot以及间接免疫荧光实验验证了 pLVX-Puro-CVS-G蛋白的表达,随后用嘌呤霉素筛选到稳定表达CVS-G的N2a细胞系。第二部分:制备抗狂犬病毒单克隆抗体MRTX849体内。将灭活的RABV的CVS毒株的BALB/c乳鼠脑组织研磨上清液作为抗原免疫小鼠,增强免疫后,小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,用间接免疫荧光法(IFA)检测阳性克隆,经过3次阳性筛选与亚克隆,得到抗狂犬病毒的特异性抗体。通过Western blot检测、酶联免疫测定、免疫荧光等方法对单克隆细胞进行鉴定,采用细胞ELISA及荧光抗体中和实验对单克隆抗体的中和活性进行检测,应用免疫PCR检测单克隆抗体对狂犬病毒粒子的识别效果。最终,获得4株抗RABV的单克隆抗体,其中,3株识别狂犬病毒的G蛋白,且这3株抗体均具有识别病毒粒子以及中和病毒的能力,为后续实验奠定了基础,以及为免疫检测实验提供了必要的抗体工具。第三部分:抗狂犬病毒胞内抗体及其PROTAC分子的制备及过表达验证,以前期实验室筛选得到的抗狂犬病毒N蛋白单克隆抗体1N1,以及本次试验筛选得到的1B1、1D4抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体为基础,克隆出单克隆抗体重链与轻链可变区基因,并通过Linker相连,以pAAV-MCS为表达载体,在轻链的C端加入了 Myc标签,构建了表达抗狂犬病毒N蛋白的胞内抗体pAAV-scFv1N1-Myc,以及抗狂犬病毒G蛋白的胞内抗体pAAV-sc此网站Fv1B1-Myc、pAAV-scFv1D4-Myc。同时,以蛋白降解靶向嵌合体技术为基础,在胞内抗体的C端加了 PROTAC序列,以期能够对病毒以及病毒蛋白起到降解的作用。将构建好并测序成功的胞内抗体及其加了 PROTAC序列的重组质粒通过脂质体转染试剂转入到N2a细胞以及293T细胞中,通过免疫荧光以及WB成功验证了胞内抗体及加了PROTAC序列的胞内抗体分子的表达。第四部分:通过激光共聚焦以及免疫共沉淀在细胞层面验证了构建的胞内抗体及其PROTACs分子均能与病毒以及病毒蛋白发生相互作用。用RABV的CVS毒株感染过表达了胞内抗体及其PROTACs分子的N2a细胞上清中的病毒滴度,结果证明,胞内抗体以及其PROTACs分子在24 h时对病毒有明显的抑制作用。随后,包装了能够表达抗狂犬病毒N蛋白及G蛋白的胞内抗体及其PROTACs重组质粒的血脑屏障透过型重组腺相关病毒(rAAV-scFv1N1-Myc、rAAV-scFv1N1-Myc-PROTAC、rAAV-scFv1B1-Myc、rAAV-scFv1B1-Myc-PROTAC、rAAV-scFv1D4-Myc、rAAV-scFv1D4-Myc-PROTAC),同时,设置了阴性对照组(rAAV-MCS)。最后,进Infiltrative hepatocellular carcinoma行病毒的纯化与滴度测定,以BALB/c小鼠及C57/BL6小鼠为模型,将纯化后的重组腺相关病毒以1011copies/只小鼠,通过尾静脉注射入小鼠体内,两周后,对注射过重组腺相关病毒的小鼠攻毒,观察小鼠的生存期。本研究构建了稳定表达CVS-G的N2a细胞系,成功制备出了抗RABV单克隆抗体,并在此基础上制备了胞内抗体及其PROTACs的胞内抗体分子。以能够透过血脑屏障的重组腺相关病毒为载体,对靶向N蛋白与G蛋白的胞内抗体及其PROTACs分子进行表达,包装了具有血脑屏障穿透能力的重组腺相关病毒,并在体内与体外对其抗狂犬病毒活性进行评价,为狂犬病的免疫治疗提供了新思路。