蛋白质类生物标志物是疾病诊断的重要指标,其在人体内的含量变化与疾病进程密切相关,也能够作为疾病诊疗的有效依据。临床检验中,准确可靠的测定结果须具备可溯源性和可比性,因此需要建立相应的标准物质和参考方法。蛋白质存在分子量大、结构复杂,不稳定等特点,定量测定时的影响因素多,检测结果变异系数高,这类标志物测定结果的可靠性和可溯源性目前还处于较低水平。因此开发蛋白质类生物标志物准确定量方法对于实现其测量的标准化具有重要意义。D-二聚体是人体内纤维蛋白降解的最小产物,是临床上排除深静脉血栓形成(DVT)、弥散性血管内凝血(DIC)和肺栓塞(PE)的重要生物指标。目前临床上主要使用基于单克隆抗体的方法对D-二聚体进行定量检测,包括乳胶凝集法、酶联免疫吸附法或免疫荧光法(ELISA/ELFA)、全血凝集法和胶体金免疫过滤法。事实上,除了最小尺寸的D-二聚体,临床上检测的D-二聚体抗原还包含具有多个D-二聚体特征结构的纤维蛋白降解产物(FDPs)。由于D-二聚体检测的被测量不明确,国GSKJ4体内际上目前没有相应的标准物质和参考测量方法,并且不同的单克隆抗体和不同结构的D-二聚体抗原之间存在结合能力的差异,各种检测方法测定的结果可比性差,准确度低,极大地限制了D-二聚体在临床诊断和治疗中的应用。同位素稀释质谱法被认为是目前蛋白质定量参考程序开发的基准方法,有着高准确度、高灵敏度、可溯源性、检测范围宽等优点。但目前临床上还未有基于该方法对D-二聚体进行高准确度测定的报道。本研究在蛋白质酶解和同位素稀释质谱法的基础上,使用D-二聚体胰蛋白酶酶解产生的特征交联肽段代替D-二聚体,建立了基于同位素稀释质谱法的D-二聚体准确定量方法。主要研究内容如下:(1)通过优化D-二聚体蛋白胰蛋白酶酶解条件和定量检测时色谱质谱条件,结合同位素稀释质谱法,建立了能够准确定量溶液内D-二聚体含量的特征肽段-同位素稀释质谱法,方法在0.05-5μg质量区间内有良好的线性,线性相关系数达0.99。(2)以免疫磁分离技术为ABT-263研究购买基础,对人血浆中的D-二聚体进行分离和提取,并对富集和洗脱条件进行了优化。采用添加法制备不同浓度水平的D-二聚体血浆样本,按照最佳条件进行分离和提取,使用特征肽段-同位素稀释质谱法成功定量出血浆样本中的D-二聚体浓度,方法的加标回收率在76.68%到119.32%之间,定量限为0.42μg/m L(DDU),线性范围为0.42-17.01μg/m L(DDU),线性相关系数为0.99。(3)对特征肽段-同位素稀释质谱法和市售的免疫比浊法试剂盒在血浆中的定值结果进行比较,由于确定了被测量,特征肽段-同位素稀释质谱法定量的灵敏度和准确度更好,定量结果与试剂盒定值结果具有良好的相关性,皮尔森系数为0.99。本研究成功建立了定量D-二聚体的特征肽段-同位素稀释质谱法,并分别对溶液内和血浆中的D-二聚体进行了准确测定。该方法明确了D-二聚体定量时的被测量,提升了D-二聚体定量检测结果的准确性和可比性,并与临床现有定量方法相关性良好,为D-二聚体标准物质的研HNF3 hepatocyte nuclear factor 3制和参考方法的开发奠定了基础。