背景本团队30多年来研究针刺穴位启动的效应机制规律,在肯定针刺有效的基础上,从神经、内分泌、免疫等多个角度研究针刺后“穴网络”中各种化学物质和针刺效应的关系,但是缺少对穴区生物物理学变化的研究。本研究在针刺“得气”的前提下,建立针刺双侧足三里穴改善佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)小鼠炎性痛平台,发现针刺可上调穴区机械敏感性离子通道(Mechanosensitivity of ion channels,MCs)的基因表达,提示离子通道在穴区启动及针刺镇痛效应中发挥重要作用,参与针刺信息的上行传递。本研究将瞬时受体电位A1离子通道(transient receptor potential ankyrin 1,TRPA1)作为接受穴位刺激的重要感受器,明确针刺对穴区TRPA1表达的影响及TRPA1是否介导穴区针刺镇痛效应的产生,为针刺穴位效应启动机制提供新的科学证据,为说清楚、讲明白针刺作用原理提供实验依据。方法研究内容一针刺对小鼠足三里穴区TRPA1表达的研究在正式实验开始前3天以行为学指标足底热辐射痛(PWL,pain withdraw latency)和机械痛(PWT,pain withdraw threshold)筛选出痛阈值稳定的C57BL/6J小鼠,将小鼠根据基础值随机分为3组:对照组、模型组、针刺组,每组8只,模型组、针刺组小鼠右侧足底注射50 ul完全弗氏佐剂(CFA,complete Freund’s adjuvant),并于造模后20小时左右进行行为学指标的测量。在第1、2、3天对针刺组小鼠进行手针双侧足三里干预,模型组和对照组采取在相同时间段内用同样方式固定,于每日针刺后测量行为学指标。第3天针刺结束后进行取材,运用免疫组化和免疫荧光染色技术,观察足三里穴区TRPA1的蛋白表达情况,并检测肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞TRPA1蛋白的表达情况。研究内容二穴区TRPA1介导针刺镇痛效应的研究1.基因敲除TRPA1对小鼠针刺镇痛效应影响的实验研究将转基因动物进行雌雄交配,在4周左右进行分笼离乳,通过基因鉴定技术,从繁育出的小鼠中鉴定出纯合基因敲除雄鼠和同窝野生型雄鼠,小鼠8周左右用于正式实验,在正式实验开始前3天以行为学指标PWL和PWT筛选出痛阈值稳定的小鼠,根据基础值进行随机分组,确认组间各项行为学指标基础值无差异,将小鼠随机分为6组:WT+对照组、WT+模型组、WT+针刺组,KO+对照组、KO+模型组、KO+针刺组,每组8～9只,模型组和针刺组小鼠右侧足底注射50 ul CFA及3%交叉菜胶,分两批动物实验进行。小鼠于造模后20小时左右进行行为学的测量。在第1、2、3天对针刺组小鼠进行手针双侧足三里干预,对模型组和对照组采取在同一时间段内用同样方式固定,每日针刺后测量行为学指标。2.药理学调控穴区TRPA1对小鼠针刺镇痛效应影响的实验研究使用TRPA1受体拮抗剂HC-030031,将经痛阈初筛后疼痛阈值稳定的健康成年雄性小鼠随机分为6组,每组6只,对照+溶剂组、模型+溶剂组、针刺+溶剂组、针刺+高剂量拮抗剂组、针刺+中剂量拮抗剂组、针刺+低剂量拮抗剂组。模型组和针刺组小鼠右侧足底注射50 ul CFA,对照组足底注射50 ul生理盐水,每日针刺前30 min中往双侧足三里穴区注射20 ul拮抗剂,针刺后测量行为学指标。研究内容三穴区胶原纤维与TRPA1的相关性研究将经痛阈初筛后疼痛阈值稳定的健康成年雄性小鼠随机分为4组,每组6只,对照+溶剂组,模型+溶剂组,针刺+溶剂组,针刺+胶原酶组,模型组和针刺组小鼠右侧足底注射50 ul CFA,对照组注射50 ul生理盐水,测量造模侧PWL和PWT。对照组+溶剂,模型组+溶剂,针刺+溶剂组双侧穴区注射20 ul TESCA缓冲液,针刺+胶原酶组双侧穴区注射2.5 mg/ml的胶原酶,分别于每日针刺前30 min注射,针刺后测量行为学指标,第3天针刺结束后对针刺组和胶原酶组进行取材,运用免疫荧光染色技术,观察足三里穴区TRPA1的蛋白表达情况。结果1.针刺可改善AA小鼠炎性痛,针刺增加了穴区TRPA1阳性的肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞表达量。对照组小鼠足底PWL和PWT在针刺1、2、3天无统计学差异。使用CFA造模后,模型组、针刺组的足底PWL和PWT值显著降低,与对照组比较有显著统计学差异(P<0.01);与模型组相比,治疗组小鼠在针刺干预后PWL和PWT值明显升高(P<0.01)。染色结果显示,与模型组相比,针刺组TRPA1阳性表达增加(P<0.01)。与对照组比较,模型组穴区肥大细胞有上升趋势,无统计学差异(P=0.70),与模型组相比,针刺组穴区肥大细胞数量明显增加(P<0.01)。与对照组比较,模型组穴区TRPA1阳性的肥大细胞表达量有上升趋势(P=0.44),与模型组相比,针刺组穴区TRPA1阳性的肥大细胞表达量明显增加(P<0.01)。与对照组比较,模型组穴区巨噬细胞数量增加(P<0.05),与模型组相比,针刺组穴区巨噬细胞数量明显增加(P=0.000)。与对照组比较,模型组穴区TRPA1阳性的巨噬细胞表达量有上升趋势(P=0.0https://www.selleck.cn/products/mrtx849.html68),与模型组相比,针刺组穴区TRPA1阳性的巨噬细胞表达量明显增加(P<0.01)。与对照组比较,模型组穴区成纤维细胞有上升趋势(P=0.048),与模型组相比,针刺组穴区成纤维细胞数量明显增加(P<0.01)。与对照组比较,模型组穴区TRPA1阳性的成纤维细胞表达量有上升趋势(P=0.068),与模型组相比,针刺组穴区TRPA1阳性的成纤维细胞表达量显著增加(P<0.01)。2.基因敲除小鼠针刺镇痛效应降低。CFA模型:WT和KO对照组小鼠足底PWL和PWT值在针刺1、2、3无统计学差异。WT小鼠和KO小鼠造模侧足底PWL与对照组相比明显降低(P<0.01)。KO模型组PWL相比于WT模型组,有上升趋势,第3天(P<0.05),WT模型小鼠和KO模型小鼠造模侧足底PWT与对照组相比明显降低(P<0.01),KO模型组PWT相比于WT模型组,有上升趋势,第2、3天(P<0.05),经针刺干预后,WT和KO小鼠PWL,相比于模型组呈现逐渐上升趋势,WT小鼠针刺1、2、3天(P<0.01),KO小鼠针刺1、3天(P<0.01),第2天(P<0.05)。KO针刺组比于WT针刺组,针刺效应明显下降(P<0.01)。WT和KO小鼠PWT相比于模型组呈现逐渐上升趋势,WT小鼠针刺1、2、3天(P<0.01),KO小鼠针刺第2天(P<0.01),针刺第1、3天(P<0.05)。KO小鼠针刺组相比于WT针刺组,针刺效应下降,针刺第1天(P<0.05)。交叉菜胶模型:WT模型小鼠和KO模型小鼠造模侧足底PWL与对照组相比明显降低(P<0.01)。KO模型组PWL相比于WT模型组,有Taurine IC50上升趋势,第1、3天(P<0.05);WT模型小鼠和KO模型小鼠造模侧足底PWT与对照组相比明显降低(P<0.01)。KO模型组PWT相比于WT模型组逐渐上升,第1天(P<0.05),第2、3天(P<0.01),针刺干预后,WT和KO小鼠PWL相比于模型组逐渐上升,WT和KO小鼠针刺3天有显著统计学差异(P<0.01)。KO针刺组相比于WT针刺组,针刺效应下降,第1、3天有统计学差异(P<0.01),第2天(P<0.05);针刺后,WT和KO小鼠PWT相比于模型组逐渐上升,WT小鼠针刺1、2、3天(P<0.01),KO小鼠针刺第1天(P<0.01),针刺第3天(P<0.05)。KO针刺组相比于WT针刺组,针刺效应下降,针刺第1、2天(P<0.01)。3.拮抗穴区TRPA1降低针刺镇痛效应。造模后,与对照组比,PWT明显下降(P<0.01);针刺第1天,与对照组比,模型组显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和高、中、低剂量TRPA1拮抗剂组显著上升(P<0.01);与针刺组比,高、中剂量组PWT下降(P<0.05),低剂量组有下降趋势(P>0.05);针刺第2天,与对照组比,模型组显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和高、中、低剂量拮抗剂组PWT明显上升(P<0.01);与针刺组比,高、中、低剂量拮抗剂组PWT明显下降(P<0.01);针刺第3天,与对照组比,模型组PWT显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和高、中、低剂量拮抗剂组PWT显著上升(P<0.01);与针刺组比,高、中剂量组PWT明显下降(P<0.01),低剂量有下降趋势(P>0.05);造模后,与对照组比,PWL显著下降(P<0.01);针刺第1天,与对照组比,模型组显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和高、中、低剂量拮抗剂组PWL显著上升(P<0.01);与针刺组比,高、中剂量拮抗剂PWL明显下降(P<0.01),低剂量有下降趋势(P=0.093);针刺第2天,与对照组比,模型组显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和中、低剂量组PWL显著上升(P<0.01),高剂量组上升(P<0.05);与针刺组比,高、中剂量拮抗剂组PWL显著下降(P<0.01),低剂量有下降趋势(P=0.330);针刺第3天,与对照组比,模型组显著下降(P<0.01);与模型组比,针刺组和高、中低剂量拮抗剂组PWL显著上升(P<0.01);与针刺组比,高、中、低剂量组PWL显著降低(P<0.01)。4.胶原酶溶解穴区胶原纤维部分降低针刺镇痛效应,且穴区TRPA1阳Zinc-based biomaterials性的肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞表达量降低。对照组小鼠PWL 3天无差异,保持平稳。模型组PWL较对照组比明显下降(P<0.01)。针刺第1、2、3天,造模测PWL显著上升(P<0.01)。针刺+胶原酶组第1、2、3天,造模测PWL显著上升,与针刺+溶剂组比,PWL显著下降(P<0.01);模型组PWT较对照组比明显下降(P<0.01)。针刺第1、2、3天,造模测PWT显著上升(P<0.01),针刺+胶原酶组PWT在第1天有上升趋势(P>0.05),第2天PWT上升(P<0.05),第3天PWT明显上升(P<0.01),与针刺组+溶剂比,PWT在第1、2、3天明显下降,在第1、3天(P<0.01),第2天(P<0.05)。说明胶原酶部分拮抗针刺镇痛效应。荧光结果显示:与针刺组相比,胶原酶组TRPA1阳性表达显著减少(P<0.01)。与针刺组相比,胶原酶组穴区肥大细胞数量降低(P<0.05),胶原酶组穴区TRPA1阳性的肥大细胞表达量明显降低(P<0.01)。与针刺组相比,胶原酶组穴区巨噬细胞数量明显降低(P<0.01)。胶原酶组穴区TRPA1阳性的巨噬细胞表达量降低(P<0.01)。与针刺组相比,胶原酶组穴区成纤维细胞数量明显降低(P<0.05),胶原酶组穴区TRPA1阳性的成纤维细胞表达量降低(P<0.01)。结论:1.针刺增加足三里穴区TRPA1阳性的肥大细胞、巨噬细胞、成纤维细胞表达量。2.TRPA1的基因敲除小鼠降低针刺镇痛效应。3.穴区局部拮抗TRPA1可降低针刺镇痛效应,且具有浓度依赖性。4.调控穴区胶原纤维可影响针刺镇痛效应及穴区TRPA1的表达。胶原纤维可能是穴位刺激调控TRPA1表达的触发因素之一。5.TRPA1参与了针刺穴位效应的启动。