安莎三烯(ansatrienins)是安莎家族的21元大环内酰胺,其C-11位有一个特征性的N-酰基-D-丙氨酰化修饰,该侧链对ansatrienins的生物活性至关重要。前期研究已证实该侧链由独特的D-丙氨酰化酶AstC和酰基转移酶AstF1顺序催化形成。其中,D-丙氨酰化酶AstC是由“A-T-TE”三结构域组成的单模块非核糖体肽合成酶(NRPS),腺苷化结构域(A domain)负责D-丙氨酸的活化,TE催化酯键的形成。美登木素是另一类重要的安莎家族成员,其C-3位具有N-酰基-L-丙氨酰化侧链,该结构与安莎三烯的N-酰基-DAZD6738作用-丙氨酰侧链具有明显相似性,我们推测其也通过类似的机制合成。AstC在体内可以检测到微弱的美登木素类C-3位D-丙氨酰化活性为该推测提供了一定支持,同时,该结果也为通过合成生物学设计合成重要的抗肿瘤药物前体L-丙氨酰美登醇指明了方向。为了阐明D-丙氨酰化酶腺苷化结构域的结构特点及其对D-Ala的识别机制,我们以AstC及其同源蛋白AnsC、MycC、SY的Adomain为研究对象,开展了如下研究并取得一些进展:1)对D-丙氨酰化酶的Adomain进行了基本的理化性质分析,建立并优化了截短蛋白表达体系,实现了目的蛋白的高效表达与纯化。2)通过晶体搜索和优化、衍射数据收集与处理、结构解析,获得了 SY-A蛋白分别与D-Ala-SA、D-Phe-AMP底物的复合物结构,复合物结构都包含两个三维结构基本相同的蛋白分子的不对称单位,均形成了 AMP结合口袋和氨基酸结合口袋,且均位于Acore和Asub两个子结构域之间的裂缝处。3)通过同源蛋白结构叠合和序列对比分析定位了底物结合口袋的关键氨基酸残基,相应突变体的酶活实验receptor-mediated transcytosis证实BMS-354825价格高度保守残基对腺苷化催化反应具有重要的作用,且当氨基酸底物位阻较大时,底物可能会采取非经典的结合方式,朝向另一侧的口袋。D-丙氨酰化酶A domain对D-Ala有明显偏好,对Gly和位阻稍大氨基酸具有一定的容忍度。4)尝试对SY-A进行底物选择性改造以实现L-Ala的加载激活。结合晶体结构和计算机辅助的模拟突变,获得了活性以及对L-Ala的选择性均有所提高的突变体,虽未实现对L-Ala的专属选择性,但为后续改造提供了方向和思路。本文通过蛋白表达和结构生物学研究,初步阐明了安莎三烯D-丙氨酰化酶对酰基供体氨基酸底物的立体构型识别机制,并尝试通过突变获得催化活性改善的突变体,为进一步通过理性/半理性改造获得高效的美登木素L-丙氨酰化酶奠定了坚实的基础。