研究背景骨髓炎是由致病微生物感染导致骨与周围软组织炎症和破坏的疾病,对患者及医生来说都是极大的挑战。目前骨髓炎治疗后复发率高,其主要原因是对骨髓炎的致病机制仍了解甚少。衰老会导致个体对感染性疾病的易感性增加且预后变差,但是衰老在骨髓炎中的作用机制尚未明确。固有免疫细胞是机体抵抗病原菌的第一道防线,对于其在衰老过程中的功能改变及机制,目前尚未完全阐明。因此,本研究将在小鼠急性感染性骨髓炎模型上明确衰老相关病理改变,并阐明衰老相关固有免疫细胞的功能改变机制及其在骨髓炎急性期病变中的作用,为防治衰老相关免疫功能下降及骨髓炎易感性提供新思路。研究方法与结果为探索衰老对小鼠急性感染性骨髓炎的影响,采用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)感染来制作小鼠内植物相关骨髓炎模型,于术后第3天取材。用细菌定量涂板和组织免疫荧光检测骨组织S.aureus负荷,发现10月龄感染小鼠的细菌载量高于8周龄感染小鼠。H&E染色提示10月龄感染小鼠骨组织损伤加重。进一步取术侧骨髓内细MRTX849价格胞用流式细胞术检测发现8周龄感染小鼠与同年龄非感染对照小鼠相比,CD11b+Ly6G-F4/80+巨噬细胞、CD11b+Ly6G-F4/80-CD11c+Ly6C+树突状细胞以及 CD11b+Ly6Chigh 炎症单核细胞和CD11b+Ly6Clow非炎症单核细胞占骨髓腔总细胞的比例明显上升;而10月龄感染小鼠与对照小鼠相比,CD11b+Ly6G-F4/80+巨噬细胞、CD11b+Ly6G+F4/80-中性粒细胞、CD11b+Ly6G-F4/80-CD11c+Ly6C+树突状细胞、CD11b+Ly6Chigh 炎症单核细胞和CD11b+Ly6Clow非炎症单核细胞占骨髓腔总细胞比例并无明显变化;同时,8周龄小鼠感染后的 CD11b+Ly6G-F4/80+巨噬细胞、CD11b+Ly6G+F4/80-中性粒细胞和CD1 1b+Ly6Chigh炎症单核细胞所占比例也高于10周龄感染小鼠。为研究调控固有免疫趋化募集的关键基因并进一步探索其参与调控年龄相关小鼠感染性骨髓炎病变差异的机制,利用生物信息分析方式对S.aureus骨髓炎年轻(10周龄)小鼠术后3天的转录组学数据(GSE166522)进行分析,结果显示C-X-C趋化因子配体10(C-X-C motif ligand 10,CXCL10)可能参与调控固有免疫细胞的趋化募集。进一步用qPCR和免疫组织化学染色检测验证:与8周龄感染小鼠相比,10月龄感染小鼠骨组织的CXCL10表达下调。为寻找CXCL10表达的主要细胞群体,通过流式细胞术发现CD11b+Ly6Chigh炎症单核细胞是CXCL10表达的主要细胞群体,并且8周龄感染小鼠的CD11b+Ly6Chigh炎症单核细胞表达的CXCL10高于10月龄感染小鼠。为了进一步探究年龄相关的单核细胞CXCL10表达下调对中性粒细胞杀菌的影响,在体外用8周龄和10月龄小鼠来源的单核细胞感染和对照条件培养基(monocytes conditioned medium treated with S.aureus,Mo-CM-S.a;monocytes conditioned medium treated with PBS,Mo-CM-con)对中性粒细胞预处理并检测其杀菌功能,结果发现8周龄小鼠来源的Mo-CM-S.a与10月龄小鼠来源的相比,能增强中性粒细胞对胞外菌和胞内菌的杀灭;而当8周龄小鼠来源的单核细胞接受si-CXCL10预处理后,其Mo-CM-S.a增强的中性粒细胞杀菌受到抑制;同时,外源性r-CXCL10刺激也能增强中性粒细胞杀灭胞外菌和胞内菌。用CXCR3抑制剂预处理中性粒细胞则可以抑制8周龄小鼠来源的Mo-CM-S.a和r-CXCL10增强的中性粒细胞杀菌。进一步用Western blot检测发现8周龄小鼠来源的Mo-CM-S.a与10月龄小鼠来源的相比,能显著上调中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)标志物蛋白 MPO 和 H3cit 的表达;而8周龄小鼠来源的单核细胞接受si-CXCL10预处理后,其Mo-CM-S.a促进的MPO和H3cit的表达受到抑制;同时,外源性r-CXCL10刺激也能促进中性粒MPO和H3cit的表达;而使用CXCR3抑制剂预处理中性粒细胞则抑制8周龄小鼠来源的Mo-CM-S.a和r-CXCL10促进的中性粒细胞MPO和H3cit的表达。为进一步探究CXCL10参与调控小鼠年龄相关的骨髓炎病理改变,在10月龄感染小鼠上使用r-CXCL10局部注射,结果发现其可以显著降低细菌负荷和组织病理损伤。为了进一步探究年龄相关的单核细胞CXCL10表达下调对巨噬细胞趋化的影响,用Transwell实验发现:8周龄小鼠来源的Mo-CM-S.a与10月龄来源的相比,可以显著促进小鼠骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的迁移,而当8周龄小鼠来源的单核细胞经si-CXCL10预处理以及BMDMs用CXCR3抑制剂预处理时,Mo-CM-S.a促进的BMDMs迁移受到抑制。为了明确趋化至感染部位的巨噬细胞是否参与调控小鼠年龄相关的骨髓炎急性期病变,用流式细胞术检测感染术后3天的骨髓内F4/80+TGF-β1+细胞比例,结果发现,相比与8周龄感染小鼠,10月龄感染小鼠的F4/80+TGF-β1+细胞占骨髓腔总细胞比例和占F4/80+巨噬细胞比例都明显下调。组织免疫荧光检测发现,相比于8周龄感染小鼠,10月龄感染小鼠局部F4/80+TGF-β1+细胞数量下降。为明确TGF-β1在小鼠感染性骨髓炎急性期中的作用,进一步对8周龄感染小鼠使用TGF-β1中和抗体和10月龄感染小鼠使用重组TGF-β1蛋白处理,结果发现改变TGF-β1对小鼠急性感染性骨髓炎的细菌载量无影响,但提高TGF-β1水平可以缓解骨组织损伤。为明确衰老导致S.aureus诱导的巨噬细胞TGF-β1表达下调的机制,在体外用胞外受体抑制剂(TLR2/8/9、NOD1/2和EGFR抑制剂)处理8周龄小鼠来源的BMDMs,用qPCR检测发现TLR2和TLR9参与调控S.aureus诱导的巨噬细胞TGF-β1表达。进一步通过qPCR和Western blot检测8周龄和10月龄小鼠来源的BMDMs的TLR2和TLR9表达量,结果发现8周龄小鼠来源的BMDMs的TLR2在感染后表达上调,而10月龄小鼠来源的TLR2表达却无明显改变;TLR9的表达不受S.aureus刺激影响,但在10月龄小鼠中的表达都低于8周龄小鼠。进一步对8周龄小鼠来源的BMDMs使用TLR2和TLR9抑制剂,对10月龄小鼠来源的使用TLR2和TLR9激动剂,qPCR和Western blot检测发现年龄相关的TLR2和TLR9的表达变化可以调控BMDMs的TGF-β1表达。进一步用胞内信号通路抑制剂(JAK2、AKT、NF-kB、JNK和MEK抑制剂)处理BMDMs以寻找调控TGF-β1表达的信号通路,用qPCR和Western blot验证发现JAK2、AKT和NF-kB参与调控TGF-β1表达。并且用TLR2和TLR9抑制剂预处理BMDMs后,用Western blot验证发现TLR2和TLR9是JAK2、AKT和NF-kB信号通路的上游分子。最后用WesternOral mucosal immunization blot检测8周龄和10月龄小鼠来源的BMDMs的JAK2、AKT和NF-κB信号通路激活情况,结果发现8周龄小鼠来源的受到S.aureus刺激后可以明显激活JAK2、AKT和NF-kB的磷酸化,而10月龄小鼠来源的BMDMs受到S.aureus刺激后并不能激活这些信号通路。研究结论单核细胞来源的CXCL10的基础水平和在S.aureus诱导下的表达水平差异是引起衰老相关骨局部易感和病变差异的重要原因:衰老小鼠单核细胞CXCL10水平下降使中性粒细胞通过CXCL10-CXCR3信号产生的NETs减少和对S.aureus的清除下降,加重局部感染;其次,CXCL10减少使得巨噬细胞通过CXCR3信号趋化至感染部位的数量减少;再次,衰老也导致巨噬细胞表达的TGF-β1减少,这与趋化至感染部位的巨噬细胞数量减少共同作用,导致局部TGF-β1水平减少,加剧小鼠感染性骨髓炎急性期病理损伤;最后,衰老会导致巨噬细胞的TLR9基础表达水平下降和感染后TLR2未能上调,引起下游的JAK2和AKT/NF-κB信号的磷酸化水平下降,从而介导S.aureus诱导的TGF-β1表达PI3K/Akt/mTOR抑制剂下降。我们的研究从新的角度阐明年龄相关的骨髓炎的致病机制,为骨髓炎的早期预防、早期诊断和早期治疗的研究提供新的靶点。