目的当前中国正加速进入老龄化社会,而中国中老年人阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病率和死亡率都在不断上升,给家庭带来了极大的经济、照护压力,同时也对社会如何照护这部分病人提出新的挑战,寻求新型有效的预防治疗方式至关重要。美国食品药品监督管理局(FDA)批准的治疗药物不仅经济成本高,副作用大而且只能缓解症状。嗅觉功能障碍被证实出现在AD早期阶段,而嗅觉刺激已被广泛应用于预防认知障碍等领域。因此构建嗅觉刺激所使用的精油成分与AD相关靶点的相互作用网络,预测治疗的潜在靶点和作用机制,为后期实验验证提供理论支持。本研究探讨嗅觉刺激对Gefitinib-based PROTAC 3研究购买Aβ1-42诱导的AD模型大鼠的学习记忆能力的影响,研究其发挥作用的可能机制,为治疗AD提供新思路和理论支持。方法1.通过TCMSP、Swiss Target Prediction、Pharm mapper数据库获取精油成分对应靶点,通过Gene Cards、OMIM、Pharm GKB、TTD和Drug Bank数据库获取AD相关作用靶点,通过R软件将两种靶点取交集筛选出嗅觉刺激抗AD作用靶点。2.通过STRING数据库构建蛋Dibutyryl-cAMP白互作网络,Cytoscape 3.8.0软件对结果进行可视化,利用R软件将筛选出的关键靶点进行富集分析,然后将结果进行可视化分析。3.分子对接:在Uni Prot数据库检索目标蛋白,在PDB数据库和Pub Chem网站下载相对应文件,通过Py MOL2.4、Chem Draw、Auto Dock Tools1.5.6和Auto Dock Vina1.1.2软件进行分子对接模拟。4.将新生SD大鼠随机分为假手术组、AD模型组、嗅觉刺激组、嗅觉刺激结合丰富环境组和美金刚治疗组。两组接受刺激的大鼠在出生后第三天开始接受对应刺激直至行为学实验结束。在SD大鼠为五周龄时进行侧脑室注射手术,建立AD动物模型。术后第二天美金刚组大鼠开始通过灌胃给药(10mg/kg/day)直至行为学实验结束杀鼠取材。5.采用自发活动实验、Y迷宫、Morris水迷宫和多功能闭合式迷宫实验检测大鼠的学习记忆能力。6.免疫荧光检测大鼠大脑海马和皮质中DHE和Nrf2的表达情况。7.Western Blot检测氧化应激标志物蛋白Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1、HIF1A和突触相关蛋白NMDAR、PSD95、n NOS、SYP和GAP-43的表达。8.生化试剂盒检测氧化应激标志物GSH和GSSG的表达;检测胆碱能系统标志物Ach和ACh E的表达。Azo dye remediation9.透射电镜观察大鼠大脑海马CA1区突触超微形态结构。结果1.通过相关数据库筛选出精油成分对应靶点共381个,AD相关靶点9128个,合并后获得交集靶点311个。PPI网络含有310个节点,3824条边,节点的平均度值为24.7,筛选出40个关键靶点。关键靶点主要富集在细胞氧化应激反应的生物过程。KEGG富集分析获得68条相关信号通路。2.分子对接的结合能分数显示,五种化合物与目标蛋白Nrf2、HO-1和HIF1A等均有良好的结合效果。3.自发活动实验结果:与假手术组相比,AD模型组在总体的活动时间和活动距离与在中央区域的活动时间和活动距离均没有表现出显著差异。与AD模型组相比,嗅觉刺激组在上述实验结果均未表现出差异。4.Y迷宫结果:五组大鼠在进臂次数上没有显著差异。与假手术组相比,AD模型组自发交替反应率显著下降(P<0.01),而嗅觉刺激组和美金刚组较AD模型组的自发交替反应率显著提高(P<0.01)。5.多功能闭合式迷宫结果:与假手术组相比,AD模型组的寻找水源潜伏期显著增加(P<0.01),而嗅觉刺激组降低了寻找水源的潜伏期(P<0.05)。6.Morris水迷宫结果:与假手术组相比,AD模型组的逃避潜伏期显著增加(P<0.01),穿越平台次数减少(P<0.05),目标象限停留时间和目标象限活动距离占比显著减少(P<0.05)。与AD模型组相比,嗅觉刺激降低了逃避潜伏期(P<0.01),增加了穿越平台次数(P<0.01)和目标象限停留时间(P<0.01)等指标。7.嗅觉刺激对氧化应激的影响:与假手术组相比,DHE荧光阳性物质在AD模型组大鼠海马和皮质区域表达较强(P<0.01)。与AD模型组相比,DHE荧光阳性物质在嗅觉刺激组海马和皮质区域表达较弱(P<0.01)。与假手术组相比,AD模型组大鼠海马Nrf2(P<0.05)、HO-1(P<0.01)和NQO1(P<0.05)蛋白表达降低,而Keap1(P<0.01)蛋白表达增高。嗅觉刺激上调了Nrf2(P<0.05)、HO-1(P<0.01)和NQO1(P<0.05)的蛋白表达,降低了Keap1(P<0.01)的蛋白表达。与假手术组相比,GSH在AD模型组表达水平下降(P<0.01),GSSG在AD模型组表达增加(P<0.01)。与AD模型组相比,嗅觉刺激增加了GSH的表达(P<0.01),降低了GSSG的表达(P<0.01)。8.嗅觉刺激对突触功能及神经递质的影响:与假手术组相比,AD模型组突触数量较少,而嗅觉刺激组突触数量多于AD模型组。在形态结构上,AD模型组突触后密度增加,突触间隙模糊不清。嗅觉刺激能一定程度上逆转上述形态学变化。与假手术组相比,AD模型组大鼠海马NMDAR2a(P<0.05)、NMDAR2b(P<0.01)、PSD95(P<0.05)、SYP(P<0.01)和GAP-43(P<0.05)蛋白表达减少,促进了n NOS蛋白(P<0.05)的表达。嗅觉刺激逆转了这一病理变化。与假手术组相比,Ach在AD模型组表达较低,但不具有统计学意义,ACh E在AD模型组中表达增高(P<0.01)。与AD模型组相比,嗅觉刺激减少了ACh E的表达(P<0.01)。结论1.网络药理学筛选出嗅觉刺激抗AD作用核心靶点40个。2.嗅觉刺激通过激活Nrf2信号通路降低氧化应激水平改善AD动物模型的认知障碍。3.嗅觉刺激通过调节突触功能相关蛋白表达和神经递质的释放改善AD动物模型的认知障碍。