背景:EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)是第一个被发现的与人类肿瘤直接相关的DNA病毒,在人群中普遍存在,成人感染率可达90%。有研究表明,多种人类恶性肿瘤的发生发展与EBV感染密切相关,例如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和部分胃癌等。细胞蛋白和病毒蛋白的糖基化在病毒的感染过程和致病中具有重要作用。O-聚糖合酶葡糖胺基(N-乙酰基)转移酶3(Glucosaminyl(N-Acetyl)Transferase3,GCNT3)是一种粘蛋白型糖基转移酶,该酶在粘蛋白生物合成中的作用是催化核心2和核心4 O-聚糖的形成。研究表明,GCNT3可参与多种肿瘤的形成和发展,但GCNT3在鼻咽癌中的表达机制与生物学功能尚不清楚,EBV对GCNT3的作用需要进一步研究。目的:明确在鼻咽癌中EBV潜伏膜蛋白LMP2A对GCNT3蛋白表达的调控作用,并探讨具体调控GCNT3表达的分子机制以及GCNT3在鼻咽癌发生发展中的生物学作用,为鼻咽癌的病因学研究提供新的实验依据。材料与方法:(1)采用Western Blot检测EBV阴性鼻咽癌细胞系(CNE-1和HONE)中GCNT3蛋白和mTORC1通路相关蛋白分子的表达;免疫荧光技术检测GCNT3蛋白的亚细胞定位。(2)通过在EBV阴性鼻咽癌细胞系CNE-1和HONE中转染LMP2A重组表达质粒,构建表达外源性LMP2A的细胞模型,随后检测GCNT3表达,从而明确在鼻咽癌细胞中LMP2A对GCNT3蛋白表达的影响。(3)分别采用mTORC1特异性抑制剂雷帕霉素(Rapamycin)和mTORC1激活剂MHY1485处理CNE-1和HONE细胞,Western Blot和免疫荧光技术检测GCNT3蛋白表达情况,从而明确mTORC1通路对GCNT3蛋白表达的调控作用。(4)采用特异性小干扰RNA(simTOR,siRaptor)分别靶向干扰鼻咽癌阴性细胞系CNE-1和HONE中mTOR和Raptor的表达,收集细胞提取总蛋白,检测GCNT3蛋白表达的变化,进一步明确mTORC1通路调控GCNT3蛋白表达的具体分子。(5)检测表达外源性LMP2A细胞系CNE-1-LMP2A和HONE-LMP2A中p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1的蛋白表达,分析LMP2A对mTORC1通路的调控作用。(6)采用Rapamycin处理CNE-1-LMP2A及HONE-LMP2A细胞,明确LMP2A是否可通过mTORC1通路调控GCNT3蛋白表达。(7)采用si GCNT3靶向干扰CNE-1和HONE细胞系中GCNT3表达,然后流式细胞技术分析细胞凋亡;CCK8实验检测细胞增殖能力;Transwell实验和划痕实验检测细胞迁移能力;Western Blot检测EMT相关蛋白表达的变化。(8)采用免疫共沉淀及激光共聚焦方法,验证GCNT3分别与ZEB1、mTOR的相互作用。结果:(1)外源性LMP2A表达可以上调EBV阴性细胞系CNE-1和HONE中GCNT3蛋白表达。(2)mTORC1激活剂MHY1485能够激活鼻咽癌细胞系CNE-1和HONE细胞中mTORC1信号通路并上调GCNT3蛋白表达;mTORC1抑制剂雷帕霉素处理能够抑制细胞中mTORC1信号通路并下调GCNT3蛋白表达。(3)分别在CNE-1和HONE细胞中干扰mTOR和Raptor的表达,均可抑制GCNT3的蛋白表达。(4)与对照组NC比较,外源性LMP2A表达可上调EBV阴性鼻咽癌细胞中p-mTOR、p-p70S6K和p-EBP1表达,过表达LMP2A可以激活mTORC1通路。(5)雷帕霉素处理能够下调CNE-1-LMP2A和HONE-LMP2A细胞系中的p-mTOR、p-p70S6K和p-EBP1表达,使mTORC1通路失活,并可部分逆转LMP2A导致的GCNT3表达上调。(6)干扰鼻咽otitis media癌细胞系CNE-1和HONE细胞中GCNT3的表达可以抑制细胞的增殖和迁移,对细胞凋亡无明显影响。(7)干扰CNE-1和HONE细胞中GCNT3表达可下调mTO更多RC1通路相关蛋白p-mTOR、p-p70S6K以及p-4EBP1的表达。(8)在CNE-1细胞系确定了GCNT3分别与mTOR和ZGDC-0973EB1的相互作用关系。结论:(1)LMP2A可通过激活mTORC1信号通路促进GCNT3蛋白表达,GCNT3通过与mTOR相互作用正向反馈调控mTORC1信号通路。(2)GCNT3表达可促进细胞增殖和迁移,在鼻咽癌的发生发展中发挥促癌作用。(3)LMP2A-mTORC1-GCNT3途径通过调节下游EMT进程中相关基因表达并与ZEB1相互作用促进细胞迁移。