松萎蔫病(pine wilt disease,PWD)又称松材线虫病,是针对松林的一种重大检疫性疾病,黑松(Pinus thunbergii Parl.;Black pine)遭受松材线虫病的严重危害。目前对PWD的防控手段主要靠杀灭病源松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus;pine wilt nematode,PWN)和主要传播源松墨天牛(Monochamus alternatus)。从分子生物学角度开展黑松抗病育种的时间较短,黑松抗病NVP-TNKS656配制分子机制的研究也落后于其他近缘树种,黑松抗松材线虫病相关的micro RNA(miRNA)及其靶基因的功能分析更是少之又少。因此,本研究以松材线虫接种黑松幼苗第5天的针叶为材料,进行转录组测序和miRNA测序,筛选抗病相关的miRNA及其靶基因并进行功能鉴定,研究miRNA在黑松抗病过程中的调控作用。主要研究结果如下:1.以两年生黑松幼苗为实验材料,接种松材线虫,第5天时松材线虫发生了10cm范围内的转移;苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)等酶活性,叶绿素、丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白、总酚和类黄酮等物质含量均在第5天时发生改变,且处理组比对照组变化幅度更大。因此,我们选取松材线虫侵染黑松第5天的松针为样品,用于转录组和miRNA测序。2.转录组测序结果显示,感病黑松幼苗中有647个基因差异表达,其中277个表达上调,370个表达下调。差异表达基因多涉及代谢过程、细胞过程、应激反应、结合和催化活性等功能,参与硫胺素代谢、次生代谢产物的生物合成和分解、植物-病原菌互作等通路。miRNAs测序分析结果得出显著差异表达的miRNAs共42个,其中26个表达上调,16个表达下调。差异表达miRNAs的预测靶基因功selleck抑制剂能主要分布在黑松的代谢、调控、应激、免疫及催化等生物学过程,多参与RNA聚合酶、内吞作用、植物激素信号转导及剪接体4个通路。转录组与miRNA测序数据联合分析后,筛选出两组抗病相关的miRNA-m RNA关系对:novel-m0263-5p与unigene0016Papillomavirus infection763、novel-m0317-5p与unigene0041830,unigene0016763和unigene0041830的功能注释都为富亮氨酸重复类受体激酶1(Leucine-rich repeat receptor-like kinases 1,LRK1)。通过荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,q RT-PCR)实验验证了novel-m0317-5p与其靶基因unigene0041830的靶向调控关系,以novel-m0317-5p与unigene0041830为研究对象,进一步分析miRNA与其靶基因m RNA在黑松抗病过程中的功能。3.对无菌黑松幼苗体内的novel-m0317-5p进行干扰表达处理后,其靶基因unigene0041830的表达相应下降。利用松材线虫侵染黑松幼苗,干扰处理的幼苗在第5天明显萎蔫黄化,抗病能力降低,而对照组生长状况良好,表明novel-m0317-5p及靶基因unigene0041830具有抗病调控作用。利用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术获得unigene0041830基因的完整序列,全长3081 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长2679 bp,编码892个氨基酸。该基因编码蛋白存在跨膜区域,分子质量约为99.63k Da,理论等电点(p I)为5.46,不存在信号肽区域;预测蛋白包含LRR(Leucine-rich repeat domain)结构域和丝氨酸-苏氨酸/酪氨酸蛋白激酶(Serine-threonine/tyrosine-protein kinase)催化结构域。