黄曲霉毒素B_1(AFB_1)是一种次级代谢产物,具有高度的肝毒性、肾毒性和免疫毒性。AFB_1以其毒性、致癌和致畸突变作用而闻名,被世界卫生组织归类为I类致癌物。花生是最容易被黄曲霉毒素浸染的作物之一,花生脱脂后的副产物花生粕富含花生蛋白,但因毒素含量超标使其在饲料和食品领域的应用受限。因此AFB_1的脱除成为研究的热点。目前AFB_1的脱除方法主要分为物理、化学和生物脱毒法,生物脱毒法因具有效率高、能耗低、绿色环保等优点,受到人们的青睐。因此本研究选用生物法脱除AFB_1,采用香豆素为唯一碳源,以AFB_1降解率为指标,从不同原料中筛选出AFB_1高效降解菌株Burkholderia sp.D6,并对其降解AFB_1的产物结构和毒性进行表征,探究Burkholderia sp.D6对AFB_1的降解机制;结合转录组技术对优势菌株Burkholderia sp.D6中的黄曲霉毒素降解酶及其相关基因进行挖掘,并揭示其对AFB_1的代谢途径;最后将Burkholderia sp.D6应用于花生粕中AFB_1的降解,生产饲用发酵花生粕并分析花生粕品质。主要研究结果如下:选取土壤、花生、花生粕和羊粪等原料为筛菌来源,进行富集培养,经过初筛和复筛后挑选出高效降解AFB_1的菌株,并对发酵条件进行优化。经以香豆素为唯一碳源的摇瓶培养和平板初筛,获得90株生长状态良好的细菌。加入AFB_1标准溶液进行复筛后得到16株可有效脱除AFB_1的菌株,筛选AFB_1降解率(66.93%)最高的D6为优势菌株,经菌株鉴定确定D6为伯克霍尔德属(Burkholderia),并对Burkholderia sp.D6的生长曲线进行测定,结果表明Burkholderia sp.D6在LB培养基孵育18 h后进入对数生长期。以AFB_1脱除率为指标,通过正交优化实验得到Burkholderia sp.D6脱除黄曲霉毒素B_1的最佳条件为:发酵时间为84 h,发酵温度为37℃,接种量为10%,初始p H为7.0,在此条件下AFB_1脱除率为(87.91±2.32)%。选用不同方式处理发酵液组分,确定D6对AFB_1的生物脱除方式,通过UPLC-MS/MS和NMR表征AFB_1的降解产物,并通过MTT法检测降解产物的细胞毒性。以细菌发酵液、发酵液的上清液和菌体悬浮液分别降解AFB_1,发酵液和上清液的效果分别为87.91%和89.12%,无显著性差异(P>0.05)。上清液的降解率远高于菌悬液,表明Burkholderia sp.D6脱除AFB_1的方式为生物降解。使用UPLC-MS/MS、~1HNMR、COSY等检测方法,鉴定出三种AFB_1的降解产物分别为P1:C_8H_4O_3;P2:C_9H_(10)O_3;P3:C_(14)H_(16)N_2O_2,并推测出其结构式。使用Hep G2检测降解产物的细胞毒性,发现降解产物共培养的细胞状态优于AFB_1共培养的细胞,表明降解产物的细胞毒性与AFB_1相比显著降低。采用转录组学技术对Burkholderia sp.D6中黄曲霉毒素降解酶基因及差异表达基因进行剖析。以不加AFB_1的样品为对照,研究Burkholderia sp.D6降解AFB_1过程中转录组的差异表达情况。结果表明,检测到的总基因数目为3541个,与对照相比,D6菌株显著差异基因有116个,其中显著上调差异基因51个,显著下调差异基因65个。GO富集分析发现Biomass yield,在生物过程中上调表达最多的基因主要涉及单有机体过程、代谢过程、细胞过程和本地化。细胞组分中Angiogenesis抑制剂上调基因主要集中在细胞、细胞部分、膜、膜部分、以及大分子复合物。分子功能中上调基因主要与催化活性、结合和运输活性有关。KEGG富集分析和Pathway代谢通路分析发现,Burkholderia sp.D6中存在大量AFB_1降解过程直接相关的酶类,如氧化还原酶、脱氢酶、过氧化氢酶和双加氧酶等,以及一些可能与AFB_1降解相关的酶的编码基因。此外还发现参与蛋白输出和细菌分泌系统的sec D、sec E、sec F、sec G、sec Y、yaj C和yid C等基因表达上调了1-3倍,cat、pca、paa等与芳香化合物代谢相关的基因显著上调。因此,推测Burkholderia sp.D6降解AFB_1的整个过程可能为:Burkholderia sp.D6受到AFB_1的刺激,AFB_1降解相关酶(氧化还原酶、过氧化氢酶等)上调表达,AFB_1在胞外被分解P1、P2、P3等产物。随后产物在双加氧酶和酯酶的作用下裂解为邻苯二酚、香草醛和苯甲酸等小分子芳香化合物,并被膜蛋白转运至细胞内部转化为乙酰辅酶A或草酰乙酸,最终进入TCA循环,为机体代谢利用。对Burkholderia sp.D6发酵花生粕的条件进行优化,并对发酵花生粕的品质进行分析。研究Burkholderia sp.D6固态发酵花生粕过程中,发酵时间、温度、菌株接种量和料液比等对花生粕中的AFB_1降解率的影响,通过响应面优化实验对Burkholderia sp.D6发酵花生粕的条件进行优化。经优化后,Burkholderia sp.D6发酵花生粕的最佳工艺条件为:发酵时间76 h,发酵温度35.82℃,菌株接种量10%,料液比1:ICI 46474溶解度0.7,AFB_1降解率为(54.21±1.22)%。发酵花生粕的粗蛋白、粗灰分和总黄酮含量分别提升了3.3%、13.3%、16%,多糖含量降低了6.2%。花生粕发酵后除蛋氨酸和赖氨酸,其余氨基酸提升量均高于27%,必需氨基酸含量提高30.77%,总氨基酸含量提高43.83%。