鳗鱼是一种具有高营养价值的资源型鱼类,但是鳗鱼在加工过程中会产生大量具有较高营养价值的下脚料,而现阶段鳗鱼加工企业对这些鳗鱼下脚料的利用较少,如何高效的开发这些加工下脚料成为提高鳗鱼资源利用率的关键点。受生活条件的改善、饮食习惯和遗传等因素影响,Ⅱ型糖尿病患者人数逐年攀升,已经成为对人类健康带来严重威胁的慢性疾病之一。研究人员在对降血糖药物的开发过程中,发现以肠促胰岛素为靶点的二肽酶基肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)抑制剂能够发挥AMG510配制较好的降糖作用。但是研究人员在对这些药物的临床应用监测中发现一些化学合成的DPP-Ⅳ抑制剂在服用过程中会出现不良反应,因此食物蛋白来源的DPP-Ⅳ抑制肽的发现成为解决这类药物副作用的一个重要突破口。因此本论文以鳗鱼下脚料为原料,论证了鳗鱼蛋白质作为制备DPP-Ⅳ抑制肽前体蛋白的潜力,优化了鳗鱼蛋白源DPP-Ⅳ抑制肽的酶解制备工艺,然后以DPP-Ⅳ抑制率为评价指标对酶解产物进行分离纯化和DPP-Ⅳ抑制肽序列鉴定,在此基础上,应用分子对接和酶促动力学分析探究DPP-Ⅳ抑制肽的抑制机理和特性,最后对鳗鱼源DPP-Ⅳ抑制肽的胃肠消化稳定性、热稳定性、p H、金属离子作用和细胞毒性进行性质鉴定。主要研究内容和结果如下:(1)首先对鳗鱼营养成分和鳗鱼蛋白质氨基酸组成进行分析,并从鳗鱼加工下脚料中提取鳗鱼粗蛋白质。然后以DPP-Ⅳ抑制率和水解度为指标,采用四种食品级蛋白酶分别对鳗鱼粗蛋白质进行水解,最终筛选出最佳蛋白酶为复合蛋白酶。ventral intermediate nucleus然后调整复合蛋白酶的最适温度和p H,以酶添加量、水解时间和底物浓度三个影响因素分别进行单因素试验,并以单因素试验的数据为基础,采用响应面法对鳗鱼蛋白质的酶解工艺进行条件优化。确定最佳的酶解工艺为:温度为50℃,p H为7.0,底物浓度为2%(w/v),酶添加量为1%(w/w),反应时间为2 h。经过验证,在最佳酶解工艺条件下制备的鳗鱼蛋白质酶解产物的DPP-Ⅳ抑制率为49.41±1.07%(2.5 mg/m L)。(2)首先采用超滤分离方法对酶解产物进行分离,鳗鱼蛋白质酶解产物先通过10k Da超滤膜,然后收集透过液通过3 k Da超滤膜,共得到的三个超滤组分:MU1(<3k Da)、MU2(3 k Da～10 k Da)和MU3(>10 k Da)均具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性,其中MU1的活性最高,其DPP-Ⅳ抑制率为32.17±0.21%(1 mg/m L),半数抑制浓度(IC_(50))为1.19±0.17 mg/m L,且超滤产物收率为46.17±1.52%。然后采用Superdex ~(TM)G-15凝胶色谱柱对MU1组分进行分离。共获得6个组分(P1、P2、P3、P4、P5、P6),经检测,P4组分的抑制率最高为54.75±1.02%(0.5 mg/m L),IC_(50)为0.4151±0.09mg/m L,最后采用制备级反相高效液相色谱分离(RP-HPLC)对P4组分进行分离,共收集到12个组分,依次命名为F1～F12。其中F4组分的抑制率最高为74.51±1.57%(0.25 mg/m L),IC_(50)为0.0923±0.06 mg/m L。对F4组分进行质谱分析后共鉴定出41条多肽序列,筛选出3条DPP-Ⅳ抑制肽序列:Phe-Pro-Arg(FPR),Tyr-Pro-Pro-Ser-Phe-Ser(YPPSFS),Tyr-Pro-Tyr-Pro-Ala-Ser(YPYPAS),其IC_(50)分别为62.14±1.47μmol/L、102.65±4.57μmol/L和68.30±3.85μmol/L。(3)使用分子对接分别探究FPR,YPPSFS,YPYPAS与DPP-Ⅳ酶的结合机制,确定了抑制肽主要通过氢键与DPP-Ⅳ酶此网站结合,其自由结合能分别为-8.30 kcal/mol、-9.20 kcal/mol和-8.60 kcal/mol。采用米氏方程和Lineweaver-Burk双倒数作图对FPR,YPPSFS,YPYPAS的抑制模式进行分析,发现FPR和YPPSFS为竞争性DPP-Ⅳ酶抑制剂,而YPYPAS则属于竞争性和反竞争性相结合的抑制剂。(4)利用体外模拟消化实验研究DPP-Ⅳ抑制肽在胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用下的稳定性,FPR,YPYPAS在胃蛋白酶和胰蛋白酶的作用下均能保持结构的稳定性,其抑制率也几乎未出现减小的现象,证明它们抗消化能力较好。而YPPSFS在胃蛋白酶的作用下出现降解的现象,DPP-Ⅳ抑制率也与空白组之间存在显著性差异,但是在后续胰蛋白酶的作用下,其保留率和DPP-Ⅳ抑制率均未出现降低的现象。然后考察了活性肽的热稳定性,YPYPAS的热稳定性较好,在95℃下加热4 h,其保留率和DPP-Ⅳ抑制率出现较小幅度的降低,而FPR和YPPSFS的热稳定较差,在70℃以上就开始出现结构降解的现象。考察了p H对考察了抑制肽稳定性的影响,FPR、YPYPAS在酸性碱性环境中均能保持较好的稳定性,而YPPSFS在酸性环境下稳定性较差,在碱性环境下稳定性较好。考察了金属离子对FPR、YPYPAS和YPPSFS稳定性的影响,在不同金属离子的作用下,YPYPAS均具有较好的稳定性,而FPR和YPPSFS的稳定性较差。使用Caco-2细胞考察FPR、YPYPAS和YPPSFS的细胞毒性,与空白组相比,不同浓度(0.05 mg/m L、0.1 mg/m L、0.25 mg/m L、0.5 mg/m L、1 mg/m L)的FPR、YPYPAS均表现出促进细胞生长作用,细胞存活率均超过100%,而YPPSFS虽然表现出抑制细胞生长的作用,但其细胞存活率也在85%以上。