创伤、感染及关节置换等原因可造成口腔颅颌面部软组织病理性钙化,引起患者颌面部疼痛、关节僵硬、运动受限等功能障碍,其中异位骨化作为病理性矿化中较严重的一个类型,是指在不应该出现钙化的软组织中出现异常的钙化组织,甚至是成熟的骨样组织。异位骨化会挤压邻近组织,给病患带来反复的疼痛,骨化严重者可危害生命。文献报道,异位骨化多见于关节或关节周边软组织中,值得注意的是,交通事故和军事行动的伤病员易发异位骨化,发病率高达50%,显著高于此疾病在其他人群的发病率。分析其中原因,可以发现这两种环境下的伤病员在外周损伤的同时往往伴发颅脑损伤。为了将此类合并颅脑损伤的异位骨化和其他原因导致的异位骨化区分开,研究人员将此类合并颅脑损伤的异位骨化统称为神经源性异位骨化(Neurogenic Heterotopic Ossification,NHO)。患者罹患神经源性异位骨化后,治疗方案多以药物对症治疗和手术切除治疗为主,但药物治疗副作用大,手术切除治疗复发率高。导致目前NHO阻断和治疗方法匮乏的主要原因是医护人员对NHO发生发展的机制认识不足。近年来学者们发现细胞外囊泡(Extracellularvesicle,EV)可以携带蛋白、核酸等生物信息,在细胞间的交流和交互调控中发挥重要的作用。有研究证实颅脑损伤发生后,患者外周血中神经源性细胞外囊泡(Neuronal-derivedextracellulaCL13900rvesicle,NEV)含量显著升高。更有研究表明,细胞外囊泡可携带白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β),高迁移率族蛋白 B1(High mobility group protein B1,HMGB1)等炎症相关蛋白,在被外周局部的细胞吞噬后,引起局部细胞及组织的损伤。这些研究都表明NEV在机体各组织间的交流中发挥重要调控作用,但其具体作用途径及机制仍不清楚。我们课题组前期的研究已经发现,细胞在炎症因子的刺激下,细胞内会发生内质网应激和线粒体功能障碍。作为细胞内钙磷代谢的重要场所确认细节,线粒体和内质网的功能障碍可导致细胞器自身钙磷浓度异常增高,从而形成无定形矿化前体。如果此时细胞发生死亡,这些无定形矿化前体可被释放到细胞外基质中,参与后续异位骨化的发生。此外,文献报道细胞发生焦亡、凋亡或坏死时,局部的核酸、焦磷酸盐等矿化原料显著增加,加重局部组织钙化。那么,颅脑损伤后神经源性细胞外囊泡是如何引起异位骨化的发生发展?这将是本研究拟解决的重要科学问题。1.研究思路在第一部分实验中,我们首先构建SD大鼠跟腱损伤异位骨化动物模型(HO组大鼠),然后构建神经源性异位骨化动物模型(NHO组大鼠),即在大鼠跟腱损伤的基础上,采用电动击锤构建可重复的重度颅脑损伤。接下来,借助Micro-CT、H&E染色等形态学表征手段,研究颅脑损伤对外周异位骨化产生的影响。在第二部分的实验中,我们通过免疫荧光、神经源性细胞外囊泡的注射实验和分泌阻断实验来研究神经源性细胞外囊泡是否参加神经源性异位骨化的发生发展。随后使用质谱仪研究神经源性囊泡的内容物,分析结果可发现神经源性细胞外囊泡具有诱导细胞焦亡的作用。最后,通过Westernblot、TEM、免疫荧光及免疫组化等技术手段研究神经源性异位骨化(NHO)大鼠创伤跟腱是否存在细胞焦亡,并通过免疫荧光进一步确认焦亡细胞的种类。在第三部分实验中,我们将分离得到的神经源性细胞外囊泡与确定的靶细胞(成纤维细胞)共培养,一方面通过免疫荧光、TEM、Westernblot等技术手段在体外环境中明确神经源性细胞外囊泡对靶细胞是否存在促焦亡和促钙化作用;另一方面通过体外的共培养实验探究细胞焦亡后培养基内钙磷浓度变化。在第四部分实验中,我们首先将神经源性细胞外囊泡回输大鼠体内,运用免疫荧光、H&E和Micro-CT等检测方法研究神经源性细胞外囊泡在体内的促焦亡作用和促钙化作用。随后,通过药物抑制细胞焦亡,再次运用免疫荧光、H&E和Micro-CT检测异位骨化局部的细胞焦亡水平和钙化产生情况,研究体内抑制焦亡对NHO发生发展的影响。2.实验结果第一部分实验通过比较颅脑损伤合并跟腱创伤(NHO组)大鼠模型和单纯跟腱创伤(HO组)大鼠模型后发现,NHO大鼠模型中跟腱异位骨化的概率显著高于HO大鼠模型(p<0.05),造模后3周和5周NHO大鼠模型中异位骨化的骨体积分数和骨密度均显著大于HO大鼠模型(p<0.05)。组织学染色显示,正常跟腱为致密的有序排列的胶原纤维;创伤跟腱胶原纤维断裂,排列紊乱,局部炎细胞浸润。造模后3周,NHO组大鼠跟腱局部出现微小的钙化结构;此时HO组大鼠跟腱局部以增生纤维为主,未见明显钙化结构。造模5周后,NHO组大鼠跟腱局部出现大面积钙化,钙化中间出现骨髓腔结构;HO组的大鼠跟腱局部亦出现含有骨髓腔的异位骨化,但其骨小梁厚度和数量显著小于NHO组(p<0.05)。在第二部分的实验中,静脉注射神经源性细胞外囊泡的HO组大鼠跟腱异位骨化的骨体积分数、骨密度、骨小梁厚度和骨小梁数均显著大于HO组大鼠模型(p<0.05)。然而,静脉注射细胞外囊泡分泌抑制剂的NHO大鼠跟腱异位骨化的骨体积分数、骨密度、骨小梁厚度和骨小梁数均小于NHO大鼠模型(p<0.05)。其次,对NHO的质谱检测结果显示,NEV携带了 HMGB1炎性蛋白,该蛋白可诱导细胞焦亡。造模后1周,NHO大鼠跟腱创伤局部的死亡细胞占比明显高于HO大鼠(p<0.05)。此外,NHO大鼠跟腱创伤局部NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3)阳性细胞占比和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(acticomorbid psychopathological conditionsve cysteinyl aspartate specific proteinase,Active CASPASE-1)阳性细胞占比均显著高于HO大鼠跟腱创伤局部(p<0.05)。此外,免疫荧光染色结果进一步确认NHO大鼠模型跟腱局部的焦亡细胞主要为成纤维细胞。在第三部分实验中将前期分离得到的3种细胞外囊泡EV:EV(从NHO大鼠血浆中分离得到的总细胞外囊泡),NEV(从NHO大鼠血浆中分离纯化的神经源性细胞外囊泡)和NEV-depleted EV(从NHO大鼠血浆总细胞外囊泡分离出NEV后剩余的非神经来源的细胞外囊泡)分别与成纤维细胞进行共培养。NEV组的N-GSDMD荧光强度和茜素红着色面积均显著大于(NEV-depleted EV)组(p<0.05)。(NEV+焦亡抑制剂)组的N-GSDMD荧光强度显著低于NEV组(p<0.05)。(NEV+焦亡抑制剂)组在培养7天后茜素红的着色面积显著小于NEV组(p<0.05)。茜素红表征显示共培养7天后(NEV-depleted EV)组和(NEV+焦亡抑制剂)组中的钙化结节明显少于NEV组(p<0.05)。元素分析的结果显示NEV组的钙含量显著高于(NEV-depleted EV)组和(NEV+焦亡抑制剂)组(p<0.05)。此外,研究还发现成纤维细胞焦亡后培养基中的钙磷元素含量增高(p<0.05)。第四部分实验中,HO组大鼠静脉注射NEV后局部细胞N-GSDMD阳性细胞占比显著提高(p<0.05),其中N-GSDMD阳性中NEV阳性的占比高于70%。NEV注射后大鼠跟腱创伤局部钙磷含量显著提高(p<0.05)。NHO组大鼠模型静脉注射焦亡抑制剂,跟腱创伤局部N-GSDMD阳性细胞显著减少。造模后3周(NHO+焦亡抑制剂)组跟腱异位骨化的骨体积分数和骨密度显著小于NHO组大鼠(p<0.05)。3.结论1.本实验成功构建了神经源性异位骨化大鼠模型,在造模相同时间后NHO大鼠模型比HO大鼠模型跟腱局部异位骨化程度更严重。2.神经源性细胞外囊泡在NHO的发生发展中发挥了重要的促进作用。NEV携带HMGB1蛋白,可触发细胞焦亡。在神经源性异位骨化大鼠创伤跟腱局部,焦亡的成纤维细胞数目显著增多。3.成纤维细胞摄取NEV后发生焦亡,释放钙磷并产生微小的钙化结节。4.NEV注射可加剧跟腱创伤局部的细胞焦亡并提高局部钙磷水平促进异位骨化产生;阻断细胞焦亡可缓解神经源性异位骨化疾病的进程。综上所述,本实验发现了神经源性异位骨化发生发展的新机制,即损伤的中枢神经系统释放具有促炎作用的神经源性细胞外囊泡进入外周循环,被外周损伤局部的成纤维细胞摄取并导致成纤维细胞的焦亡,细胞焦亡释放的钙磷在跟腱局部沉积形成钙化结节,加速了神经源性异位骨化的发生发展。