癌症已成为严重危害人类生命和生活质量的主要疾病之一,其发病率逐年上升。Dibutyryl-cAMP试剂在多种癌症的发生发展过程中,Ras是最早发生突变的基因之一,也是最常发生突变的原癌基因之一。Ras基因编码的Ras蛋白是一类固有的GTP结合蛋白,在与GDP结合的失活状态(Ras-GDPNSC 119875 IC50)和与GTP结合的活化状态(Ras-GTP)之间不断转换而达到动态平衡。鸟嘌呤核苷酸交换因子SOS1能够催化Ras加载GTP,处于持续活化状态,从而引起下游信号通路紊乱,最终导致癌症的发生。抑制Ras-SOS1相互作用备受关注,是一种具有潜力的抗癌治疗策略。本课题基于Ras-SOS1复合物晶体结构,分析相互作用界面中关键位点,以SOS1中的两条关键α-螺旋片段为模板,利用Fmoc固相多肽合成技术,设计合成了4条直链肽,9条全碳氢订书肽以及9条荧光标记肽。经过高效液相色谱(HPLC)分离纯化,并用电喷雾电离高分辨质谱(ESI-HR-MS)进行表征,得到纯度大于95%的目标多肽。经文献检索,所有化合物均为首次报道。首先,通过表面等离子共振(SPR)实验测定了目标多肽与靶蛋白Ras之间的结合力。实验结果显示订书肽SSOSH-5与Ras蛋白的结合力比直链肽SOSH提高了大约8倍,结合常数K_d值为3.92μM。随后通过CCK-8细胞活性实验测试了所有多肽对KRas突变型肿瘤细胞A549的细胞毒性,结果显示在10μM的SSOSH-5作用下,A549存活率极低,半数抑制浓度(IC_(50))为6.264μM。进一步,选用野生型、NRas突变型和HRas突变型多种肿瘤细胞对SSOSH-5进行CCK8实验,发现其对这些肿瘤细胞同样具有较强的细胞毒性。在10μM浓度下,SSOSH-5就能引起野生型和突变型肿瘤细胞的死亡。下一步,评价了订书肽的α-螺旋度,稳定性和透膜性。圆二色谱(CD)实验结果显示订书肽SSOSH-5的α-螺旋度达到32.4%,优于直链肽SOSH。本文选择糜蛋白酶作为水解酶模拟直链肽SOSH和订书肽SSOSH-5在体内的降解检测SOSH和SSOSH-5的稳定性。HPLC监测结果显示24 h后,大约有80%的SSOSH-5保持结构完整,优于直链肽SOSH。进一步通过流式细胞术和活细胞荧光染色实验检测了荧光标记的多肽在Ras突变肿瘤细胞中的透膜性,结果显示SSOSH-5在野生型和Ras突变型肿瘤细胞中均具有较强的细胞膜穿透性,透膜性远高于直链肽SOSH和SOS1α-H。上述实验结果表明全碳氢订书策略可以提高多肽的α-螺旋度,稳定性和透膜性。为了明确订书肽SSOSH-5抑制肿瘤细胞增殖的作用机制,本文分别用蛋白免疫印迹实验(Western blot)和Annexin-V/PI双染实验研究SSOSH-5对Ras下游信号通路的影响和抑制细胞增殖的途径。Western blot实验显示SSOSH-5能够有效下调Ras下游信号通路中ERK和AKT的磷酸化水平,从而抑制Ras突变肿瘤细胞的过度增殖。Annexin-V/PI双染实验结果表明SSOSH-5诱导A549细胞凋亡,且这种现象具有明显的时间依赖和浓度依赖关系。综上所述,本课题基于Ras-SOS复合物晶体结构,设计并合成了一系列订书肽,其中订书肽SSOSH-5展现出了较好的α-螺旋度,稳定性和透膜性,能有效结Mediation analysis合多种Ras突变蛋白,抑制多种肿瘤细胞增殖,下调A549(KRas G12S),T24(HRas G12V)和H1299(NRas Q61K)等肿瘤细胞的ERK磷酸化水平。SSOSH-5作为一种新型的pan-Ras订书肽抑制剂,具有良好的应用前景和进一步深入研究的价值。