黑色素瘤是一种预后极差的恶性肿瘤。在过去的半个世纪里,全球黑色素瘤的发病率每年都在快速增长,比任何其他癌症都要增长的更快,并且每年的治疗费用也迅速上升。过去多年的临床及基础研究针对黑色素瘤开发了多种治疗策略,但治疗效果仍不理想,特别是转移性黑色素瘤,其中位生存期和长期生存率都极低。黑色素瘤的发生与多个基因及信号通路的异常调控密切相关。因此,探索黑色素瘤发展进程的分子机制,寻找潜在的治疗靶点具有重要意义。研究背景:前B细胞白血病同源盒转录因子1(Pre-B-cell leukemia homeobox transcription factor 1,PBX1)最早是作为在急性前B细胞白血病的t(1;19)染色体易位引起的融合蛋白的一部分被发现的,它属于PBX1-4家族,是一个重要转录因Staurosporine浓度子。PBX1不仅参与调控重要的发育程序,其表达失调也与包括癌症在内的多因素疾病有关。越来越多的研究表明PBX1在许多癌症中表达异常,并且与癌症患者的不良预后显著相关。同时,PBX1与维持增殖信号、激活侵袭和转移、诱导血管生成、抵抗细胞死亡和接触细胞能量控制等肿瘤特征过程密切相关。有文献报道,PBX1在黑色素瘤细胞中表达异常上调。然而,PBX1在黑色素瘤中表达异常的分子机制、对黑色素瘤发生发展的影响以及是否可以作为黑色素瘤的生物标志物和治疗靶点亟需进一步探索Secretase抑制剂。G-四链体(G-quadruplex,G4)是由富含鸟嘌呤(G)的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列折叠形成的高级结构。由于G4具有重要的生物功能和特殊构象,其结构和功能的特性已成为化学、生物学和药学的重要研究领域。G4被发现广泛存在于基因组调控区域和各种RNA中,如癌基因启动子区、剪接和重组位点、端粒末端、micro RNA、m RNA和长非编码RNA中。由于G4在人类癌基因的启动子区和m RNA的5’非翻译区(5’untranslated region,5’UTR)中的广泛存在,它在肿瘤发生发展过程中的功能和作用机制正在被广泛研究。值得注意的是,PBX1的启动子区和m RNA中G含量极为丰富,提示PBX1的启动子区和m RNA中可能形成G4结构,并有可能参与调控PBX1的转录和翻译。研究目的:本研究通过人群研究验证PBX1在黑色素瘤患者中的差异表达情况,利用多种细胞和动物模型全面地研究PBX1在黑色素瘤的发生发展中发挥何种功能,阐明G4结构和PBX1在黑色素瘤中异常表达的关系,探讨G4结构和PBX1作为黑色素瘤生物标志物和治疗靶点的可能性,筛选靶向G4结构和PBX1的候选药物,并进行毒理学研究,评估其潜在的临床应用价值,为开发新的黑色素瘤治疗策略开辟新的道路。研究方法:收集47例配对的黑色素瘤组织及其癌旁组织样本、48例具有患者预后信息的黑色素瘤组织样本以及15例正常组织样本。其中47例配对的黑色素瘤样本用于检测PBX1表达水平,并分析PBX1表达与临床病理参数的相关性。48例黑色素瘤和15例正常组织样本用于检测PBX1表达水平,并分析PBX1表达与黑色素瘤患者预后的相关性。分别采用CCK8细胞增殖实验、黑色素体分离实验、迁移和侵袭实验来研究PBX1对原代黑素细胞和小鼠黑色素瘤B16-F10细胞的影响。采用转录组测序技术在转录水平上研究PBX1对人黑色素瘤A375细胞基因表达的影响,分析差异表达基因,并进行富集分析确定PBX1调控的下游信号通路。采用生物信息学方法,预测PBX1启动子区和m RNA转录本中潜在的G4形成序列。分别采用圆二色谱实验、热变性实验、荧光光谱实验、凝胶迁移率移位实验和染色质免疫共沉淀实验等,确定PBX1启动子区和m RNA转录本中潜在的G4形成序列能否在体内外形成稳定的G4结构。采用实时定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)、免疫印迹实验(Western blotting,WB)、双荧光素酶报告基因以及EGFP报告系统等实验,确定PBX1 G4结构形成对PBX1基因转录和蛋白表达的影响。通过转录因子预测软件分析PBX1启动子区G4位点附近可结合的转录因子,并利用染色质免疫共沉淀技术确定PBX1启动子区G4的形成对转录因子结合到PBX1启动子区的影响。分别采用CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验、迁移和侵袭实验以及建立黑色素瘤动物模型,确定靶向稳定PBX1 G4的PDS、TMPy P4以及反义寡核苷酸(ASO)分子对黑色素瘤体内外生长和转移的影响。并针对ASO分子开展了急性和亚慢性毒性实验,通过血常规、肝肾功能及凝血功能指标检测和组织病理学评估它是否具有临床转化价值的可能性。研究结果:1、PBX1在黑色素瘤中的功能及临床意义利用收集的黑色素瘤样本对PBX1表达水平进行量化后,发现PBX1在黑色素瘤中表达水平显著上调与正常组织相比。Kaplan-Meier生存分析显示,与PBX1低表达的黑色素瘤患者相比,PBX1高表达的患者的总体生存率和无转移生存率都要更低,表明PBX1可以作为潜在的黑色素瘤患者的预后生物标志物。在原代黑素细胞中过表达PBX1后,细胞的增殖能力、黑素体形成能力显著增强与对照组相比。在小鼠黑色素瘤B16-F10细胞系中敲除PBX1后,与对照组相比,细胞的增殖能力、迁移和侵袭能力显著减弱,表明PBX1在黑色素瘤中发挥癌基因功能。对PBX1过表达的A375细胞进行转录组测序,总计发现971个差异表达基因,其中666个基因表达上调,305个基因表达下调。通过基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes,KEGG)进行富集分析发现,这些差异表达基因主要富集于NF-κB信号通路、细胞因子和趋化因子通路、趋化因子受体通路和TNF信号通路等。通过后续实验验证发现PBX1可以通过促进NF-κB p65核易位进而激活NF-κB信号通路,最终导致细胞因子和趋化因子等信号通路的激活。以上结果表明,PBX1通过激活NF-κB信号通路在黑色素瘤中发挥癌基因功能。2、PBX1 G-四链体结构的鉴定及其功能研究首先,整合2个独立的G4预测软件,在PBX1启动子区和m RNA转录本上预测出了5个潜在的G4形成序列,其中有两个序列位于启动子区(d G1和d G2),三个序列位于m RNA转录本上(r G1,r G2和r G3)。进一步,通过利用c Gc C、G4H和G4NN算法给这5个候选序列进行打分评估其G4形成能力,发现其中位于启动子区的候选序列d G1和位于m RNA转录本5’UTR区的r G1形成稳定G4结构的能力最强。并且,这两个候选序列保守性非常高,表明它们可能发挥重要调控作用。通过圆二色谱实验、热变性实验、荧光光谱实验、凝胶迁移率移位实验和染色质免疫共沉淀等实验,证实d G1和r G1的确可以在体外和细胞内形成稳定的G4结构。而TMPy P4和PDS作为著名的G4稳定配体分子,可以结合并稳定d G1和r G1形成的G4结构。通过双荧光素酶报告基因以及EGFP报告系统实验检测PBX1 G4结构形成对基因转录和翻译的影响,首先分别将PBX1的G4形成序列d G1和r G1分别构建进入双荧光素酶报告基因的启动子区和EGFP m RNA的5’UTR区,然后通过加入TMPy P4和PDS诱导PBX1 G4结构形成。TMPy P4和PDS处理可以显著抑制荧光素酶报告基因的转录和EGFP蛋白的表达,表明PBX1 G4参与调控基因转录和蛋白翻译过程。进一步,通过q RT-PCR和WB实验检测PBX1 G4结构形成对PBX1转录和蛋白表达的影响,发现PBX1 G4结构形成可以显著降低PBX1 RNA和蛋白的表达水平,表明PBX1 G4结构形成可以抑制PBX1基因转录和蛋白表达。通过转录因子预测软件分析PBX1启动子区G4位点附近可结合的转录因子,并利用染色质免疫共沉淀技术确定PBX1启动子区G4的形成对转录因子结合到PBX1启动子区的影响。发现转录因子Zic2可以结合PBX1启动子区,并激活PBX1的转录。进一步,利用TMPy P4和PDS诱导PBX1启动子区G4形成可以显著抑制Zic2在PBX1启动子区的富集,进而抑制PBX1基因的转录。3、G4特异性配体对黑色素RNA biology瘤发展的影响通过CCK8细胞增殖实验、克隆形成实验、细胞划痕实验、迁移和侵袭实验以及建立黑色素瘤动物模型,发现利用TMPy P4和PDS诱导PBX1 G4结构形成可以显著抑制黑色素瘤细胞的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力以及在动物模型内的生长和转移。然而,动物实验显示TMPy P4具有一定毒性,限制了其临床应用。4、靶向PBX1 G4的反义寡核苷酸(ASO)的抗肿瘤活性及其毒理学研究设计合成了可以特异性靶向PBX1 r G1的ASO分子,发现ASO处理可以诱导PBX1 G4形成,并且抑制体外黑色素瘤细胞的增殖能力以及黑色素瘤病人来源肿瘤异种移植(Patient-derived tumor xenograft,PDX)模型中黑色素瘤的生长。以上结果表明,PBX1 G4可以作为潜在的黑色素瘤治疗靶点。通过毒理学实验的评估,发现ASO只在高剂量的急性毒性实验中显示出一定的急性毒性,在亚慢性毒性的实验中没有显示出毒性,提示其安全性较高,未来可能发展为潜在的治疗黑色素瘤的临床药物。研究结论:1、PBX1在黑色素瘤中表达显著上调,并且PBX1的高表达与黑色素瘤患者的不良预后显著正相关。进一步,PBX1可以通过激活NF-κB信号通路在体内外促进黑色素瘤的生长和转移。而降低PBX1表达水平可以有效抑制黑色素瘤的生长。这些结果表明,PBX1是一个潜在的黑色素瘤的生物标志物和新的治疗靶点。2、PBX1基因启动子区和m RNA的5’UTR区包含可以形成G-四链体结构的序列。3、G4配体TMPy P4和PDS可以诱导PBX1基因启动子区和m RNA的5’UTR的G4结构形成,进而抑制PBX1基因的转录和蛋白的翻译。4、转录因子Zic2可以结合PBX1在启动子区,进而激活PBX1基因转录。而PBX1启动子区的G4形成可以抑制转录因子Zic2在PBX1启动子区的富集,抑制PBX1基因转录。5、G4配体TMPy P4和PDS以及设计的ASO分子可以通过诱导PBX1 G4形成,进而在体内外抑制黑色素瘤的生长和转移。G4配体具有低特异性、低类药性和高细胞毒性等特点,限制其临床应用。ASO分子具有高特异性和低毒性的特点,未来可以作为潜在的治疗黑色素瘤的临床药物。