非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的烈性传染病,家猪和各种野猪均易感,给养猪业造成巨大的经济损失。该病毒呈现正二十面体的形态,有着庞大而复杂的基因组,给疫苗研发带来很大困难,至今缺乏针对非洲猪瘟安全理想的疫苗。G1211R基PUN30119因编码病毒的DNA聚合酶(DNA polymerase,DNApol),与病毒复制相关。B646L基因编码的p72蛋白是主要衣壳蛋白,参与病毒进入宿主。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,L.plantarum)作为益生菌,能够在宿主肠道定殖并调节宿主免疫。除此之外,它还是一种优良的外源蛋白表达菌,通过口服免疫将抗原递送到宿主肠道。p WCF载体是通过营养缺陷筛选的诱导型大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体。树突状细胞(dendritic cells,DCs)是重要的抗原提呈细胞。树突状细胞诱导肽(DCpep)由12个氨基酸组成,能与DCs特异性结合。因此本研究选用截短的DNA聚合酶、p72部分蛋白,构建了靶向树突状细胞的NC8Δ-p WCF-DNApol、NC8Δ-p WCF-p72和NC8Δ-p WCF-DNApol-p72非抗生素抗性新功能型乳酸菌。诱导后能够靶向树突状细胞,将外源抗原锚定表达在NC8/Δalr植物乳杆菌的表面。此外,通insect biodiversity过给小鼠口服免疫,来评价表达非洲猪瘟病毒融合抗原乳酸菌的免疫效果。本研究分为两个部分:(1)表达非洲猪瘟病毒融合抗原新功能型乳酸菌的构建及表达验证在NCBI网站获取ASFV-SY18基因序列(MH766894.1),通过DNAstar Protean软件分析并截短DNA聚合酶,选取p72蛋白的4个抗原表位分别做3个重复,它们分别与3个重复的DCpep序列融合,这两组目的基因融合起来构成表达两种抗原的共表达目的基因。三组目的基因优化后克隆到p WCF载体。重组质粒转入asd基因缺陷大肠杆菌(E.coliχ6212),经过酶切验证、聚合酶链式反应(PCR)验证及质粒测序,重组质粒构建成功。电转化到alr基因缺失植物乳杆菌NC8/Δalr,经过PCR验证重组质粒转化成功。DCpep多肽两次免疫白兔,收集血清,经Western Blot验证DCpep多克隆抗体制备成功。以DCpep多克隆抗体和FITC标记的抗兔二抗孵育新功能型乳酸菌,通过流式细胞术检测,与空载体(p WCF)乳酸菌相比,新功能型乳酸菌有明显的信号偏移,说明外源蛋白被成功表达。菌液经多抗和FITC标记二抗孵育,在荧光显微镜下可见新功能型乳酸菌有绿色荧光,表明外源蛋白能锚定表达在菌体表面。NC8Δ-p WCF-p72菌液经过蛋白样品处理,p72鼠单抗和HRP标记的抗鼠二抗孵育,Western Blot技术验证有预期大小的蛋白条带。(2)新功能型乳酸菌的免疫效果研究将C57BL/6小鼠随机分为5组,每组10只。设置PBS和p WCF组为对照,分别灌胃200μL PBS和1.0×10~9CFU空载体植物乳杆菌(NC8Δ-p WCF),新功能型乳酸菌组的每只小鼠分别灌胃1.0×10~9CFU活菌。在1、3、5天初免,15、17、19天进行加强免疫,第29天进行流式细胞术检测。检测了派氏淋巴结(PPs)中的CD80,CD86,MHC-II共刺激因子,结果显示,口服免疫新功能型乳酸菌显著促进DCs的活化,表达DNApol和p72的乳酸菌活化效果最好。细胞与抗原肽共培养后,新功能型乳酸菌组肠系膜淋巴结(MLNs)中CD4~+和CD8~+T细胞的IFN-γ的表达显著增加;脾脏细胞的CD4~+IFN-γ~+和CD8~+IFN-γ~+的表达也显著增加。MLNs和脾脏细胞用CFSE染色后,与抗原肽共培养3天,来测细胞增殖。结果显示,实验组MLNs中CD4~+和CD8~+T细胞数量都有所增加。在脾脏中,共表达组与PBS组相比,CD4~+T细胞极显著增加(P<0.01),CD8~+T细胞显著增加(P<0.05)。新功能型乳酸菌组PPs中B220~+IgA~+细胞数量呈增加趋势,而且p72组与对照组相比有显著差异(P<0.05)。在加强免疫2周后,通过免疫荧光法检测小鼠十二指肠、空肠、回肠中B细胞反应。利用荧光显微镜观察小鼠肠道B220~+IgA~+双阳性细胞的数量。在十二指肠和空肠中发现,对照组的双阳性细胞几乎没有,但新功能型乳酸菌组能明显看到双阳性细胞。回肠横切面的全图和局部放大图显示,新功能型乳酸菌组双阳性细胞数量明显多于对照组,说明DNApol和p72共表达组效果最好。对小鼠粪便中特异性sIgA与血清中特异性IgG、IgG1、IgG2a的表达水平进行了检测。初免和加强免疫2周后,实验组的s IgA表达水平都显著增加。分别饲喂新功能型乳酸菌的小鼠血清中特异性IgG的表达水平,在初免和加强免疫2周后及初免后10周都比空载组极显著增加(P<0.0001),初免后10周还能保持较高水平。血清中特异性IgG1、IgG2a的表达水平也是在加强免疫2周后达到最高水平,实验组在三个时期与空载组相比极显著增加(P<0.0001)。综上所述,本研究成功构建了三株新功能型植物乳杆菌,能成功表面展示DNA聚合酶截短蛋白、p72部分蛋白,以及共表达DNA聚合酶截短蛋白和p72部分蛋白。NC8Δ-p WCF-DNApol、NC8Δ-p WCF-p72和NC8Δ-p WCF-DNApol-p72经口服免疫能增强小鼠的粘膜免疫、体液免疫和细胞免疫。NC8Δ-p WCF-DNApol-p72在小鼠上的免疫效果优于NC8Δ-p WCF-DNApol和NC8Δ-p WCF-p72。因此,靶向树突状细BMS-907351化学结构胞的新功能型乳酸菌为非洲猪瘟病毒口服活载体疫苗提供了一种粘膜免疫新思路,为阻断非洲猪瘟提供了新策略。