骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome)是一组以外周血细胞减少、骨髓病态造血为主要特征的造血干细胞恶性克隆性疾病,约有1/3的MDS患者最终进展为急性髓系白血病,给人民的身体健康带来极大的危害。青黄散由青黛和雄黄组成,在我科长期的临床实践中,青黄散被发现治疗MDS具有高效且安全性良好的优点。药理机制研究发现青黄散可能通过DNA去甲基化作用发挥治疗MDS的作用。然而DNA去甲基化具有2种模式,被动去甲基化与主动去甲基化,前期研究表明,青黄散的药理机制可能涉及DNA主动去甲基化,因此本研究旨在探索青黄散的主动去甲基化作用机制,为理解青黄散的去甲基化药理作用机制提供崭新的视角。研究一:基于TET2研究青黄散对MDS的主动去甲基化作用研究目的:探索青黄散有效成分硫化砷及靛玉红通过TET2对MDS细胞株的主动去甲基化作用机制;研究方法:以MDS细胞株SKM-1为研究对象,以不同浓度的硫化砷、靛玉红干预细胞,采用CCK8法检测SKM-1细胞的细胞活力;采用DNA斑点印记方法,检测5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)、5-甲基胞嘧啶(5mC)的变化情况;采用亚硫酸氢盐测序检测SKM-1细胞PIK3R2和PTPN6基因启动子CpG位点的甲基化水平,并进行mRNA、蛋白水平的验证;通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹检测SKM-1细胞TET2的mRNA和蛋白的表达;采用蛋白免疫印迹检测硫化砷干预后对SKM-1细胞PI3K/AKT信号通路表达的影响;采用流式细胞术检测硫化砷、靛玉红、PI3K/AKT通路抑制剂LY294002干预后SKM-1细胞的凋亡情况。研究结果:(1)CCK8增殖抑制实验硫化砷有抑制SKM-1细胞活力的作用,且随浓度增加抑制作用越明显(P<0.05);不同浓度靛玉红对SKM-1细胞无显著细胞活力抑制作用。(2)DNA斑点印记实验结果显示硫化砷及靛玉红可促进SKM-1细胞5hmc表达、降低5mC表达与对照组相比,1μM、2μM、4μM、6μM硫化砷组SKM-1细胞5hmc含量均升高(P<0.05),而5mC含量明显下降(P<0.05),其中2μM硫化砷干预细胞对5hmc和5mC的影响最大。与对照组相比较,20、40、60、80μM靛玉红组SKM-1细胞5hmC含量均上升(P<0.05),而5mC含量明显下降(P<0.05),其中20μM靛玉红干预细胞对5hmc和5mC的影响最大。(3)PIK3R2和PTPN6甲基化检测以及验证实验亚硫酸氢盐测序结果显示硫化砷可降低PIK3R2甲基化水平(P<0.05),但靛玉红对PIK3R2甲基化水平无明显影响;硫化砷、靛玉红对PTPN6甲基化水平无显著影响;RT-PCR验证实验发现:与对照组相比较,硫化砷可促进PIK3R2的mRNA与蛋白水平的表达(P<0.05);靛玉红则显著抑制了 PIK3R2的mRNA表达水平(P<0.05),但对PIK3R2蛋白表达水平无显著影响。(4)青黄散对MDS细胞TET2、P-PI3K和P-AKT表达的影响与对照组相比,硫化砷可促进SKM-1细胞TET2 mRNA的表达(P<0.05),靛玉红对TET2的mRNA表达无影响。在蛋白水平,硫化砷显著抑制了 TET2蛋白的表达(P<0.05),靛玉红显著促进TET2蛋白的表达(P<0.05)。与对照组相比较,硫化砷显著抑制了 P-PI3K、P-AKT蛋白水平的表达(P<0.05),而对AKT蛋白表达水平无明显影响。(5)青黄散对MDS细胞凋亡的影响与对照组相比较,硫化砷能够显著促进SKM-1细胞凋亡(P<0.05),靛玉红对SKM-1细胞凋亡没有显著影响,LY294002能够有效促进SKM-1细胞凋亡(P<0.05)。研究结论:(1)青黄散中的有效成分硫化砷与靛玉红均存在去甲基化作用。(2)靛玉红对DNA主动去甲基化相关蛋白TET2的表达有显著促进作用;硫化砷对TET2蛋白有显著抑制作用。(3)硫化砷可treatment medical通过抑制PI3K/AKT信号通路促进SKM-1细胞凋亡。研究二:高通量测序筛选参与靛玉红促进骨髓增生异常综合征TET2表达的候选miRNAs研究目的:筛选参与靛玉红促进骨髓增生异常综合征TET2表达的候选miRNAs。研究方法:以MDS细胞株SKM-1为研究对象,以20μM靛玉红干预细胞48 h,采用高通量测序方法检测细胞的microRNA,采用TPM(Transcript Reads Number Per Million)法对数据进行标准化,使用DESeq R进行两组间的差异表达分析,筛选出差异表达的microRNA;通过基因本体(Gene Ontology,GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)分析差异的 miRNA 候选靶基因主要参与的功能和效用;使用miRanda软件对测序结果进行microRNA-TET2靶基因预测分析,筛选出可能调控TET2基因的候选microRNAs;以MDS细胞株SKM-1为研究对象,以20μM靛玉红干预细胞48 h,采用实时定量PCR对筛选出的差异表达microRNAs进行验证;研究结果:(1)靛玉红对MDS细胞miRNA表达的影响通过高通量测序分析比较了对照组和靛玉红组SKM-1细胞中miRNA表达量的差异,发现35个miRNA在两组间存在显著差异。与对照组相比较,靛玉红组中有17个miRNA表达上调,18个miRNA下调。(2)差异表达的miRNA的主要功能GO功能富集分析发现,靛玉红组下调差异表达的miRNA候选靶基因主要参与了金属离子转运、核苷酸切除修复、生物刺激反应等生物过程;上调差异表达的miRNA候选靶基因主要参与了细胞分化、细胞内信号转导、肽酰脯氨酸修饰等生物过程。KEGG通路富集分析发现,下调的miRNA候选靶基因主要参与碳代谢、果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢、病毒致癌等代谢过程及信号通路;上selleck MCC950调的miRNA候选靶基因主要参与了小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、癌症信号通路、慢性髓系白血病等。(3)调控TET2基因的候选microRNAs预测及验证通过生物信息学分析,对具有显著差异表达的miRNA进行靶点预测,发现 miRNA-29b-3p 和 miRNA-125a-5p 可能作用于 TET2。RT-PCR 实验验证了靛玉红可下调miRNA-29b-3p的表达、上调miRNA-125a-5p的表达,与miRNA测序结果一致。研究结论:(1)靛玉红可显著影响MDS细胞miRNA的表达。(2)靛玉红AZD1152-HQPA作用可能通过抑制miRNA-29b-3p的表达促进TET2的表达。