背景脑肠肽是既存在于脑也存在于胃肠道的一类小分子多肽,同时具有神经递质与内分泌激素的功能,参与调控胃肠道疾病。促进胃肠运动的脑肠肽主要有胃泌素、胃动素、胃饥饿素、乙酰胆碱、P物质等;抑制胃肠运动的脑肠肽主要有胆囊收缩素、血管活性肠肽、更多生长抑素、一氧化氮等。通常情况下,胃肠运动受到抑制通常表现为兴奋性的脑肠肽含量下降,抑制性的脑肠肽含量增加,反之亦然。下丘脑作为能量代谢调控中枢,不仅能调控摄食行为,还能调控胃肠运动。雷公藤红素(Celastrol,CEL),又叫南蛇藤素,是雷公藤活性的主要成分之一。近年来研究发现,CEL通过调节多种分子靶点,在治疗肥胖和糖尿病、癌症、炎症性疾病、自身免疫疾病、神经退行性疾病、神经病理性疼痛等方面具有很好的疗效。其中在治疗肥胖和糖尿病方面具有巨大潜力,CEL作用于多个靶器官,如肝脏、脂肪细胞、肠道等减轻肥胖小鼠的体重;CEL通过降低糖尿病模型小鼠的血糖水平、体重和食物摄入量,GSI-IX抑制剂促进胰岛素分泌来缓解糖尿病。以上现象提示CEL可能影响小鼠的胃肠运动,但目前少有相关文献进行报道,所以本课题研究CEL对胃肠运动的影响以及机制。目的探讨外周注射雷公藤红素对小鼠胃肠运动的影响及其机制。方法按照注射不同剂量的CEL分为四组:第一组对照组;第二组低剂量组:CEL 0.5mg/kg;第三组中剂量组:CEL 1 mg/kg;第四组高剂量组:CEL 2 mg/kg。1.检测腹腔注射CEL后对小鼠胃排空率的影响。小鼠禁食18 h。每只小鼠单笼饲养,进食1 h之后,立即腹腔注射CEL,2 h后开始取胃,计算胃排空率。2.检测腹腔注射CEL后对小鼠的肠推进率的影响。小鼠禁食18 h。腹腔注射CEL之后30 min开始灌碳糊,25 min后取小鼠小肠,计算小肠推进率。3.检测腹腔注射CEL后对小鼠结肠排珠时间的影响。腹腔注射CEL 30 min后开始向小鼠肛门处塞玻璃珠,距肛门距离2.5 cm。记录每只小鼠排珠的潜伏期。4.检测腹腔注射CEL后对小鼠排便功能的影响。统计每只小鼠2 h内排便的个数、湿重、干重。5.腹腔注射CEL 2 h后取小鼠组织,提取RNA,采用RT-PCR检测小鼠外周与中枢组织中Npy、Cck、Vip、Crh、Orexin、Mch、Agrp、Ghrelin、Pyy等与胃肠运动相关基因的表达水平。6.腹腔注射CEL 2 h后取小鼠血清、胃窦组织以及下丘脑组织,采用ELISA检测血清中SS、VIP、CCK、MTL、ActiveMacrolide antibiotic ghrelin、Total ghrelin、MBOAT4、GAS、NO、ACH的含量,胃窦组织中的GAS、SS、Active ghrelin、VIP、NO、ACH的含量,以及下丘脑组织中SS、GAS、Active ghrelin的含量。7.腹腔注射CEL 2 h后取小鼠胃窦组织以及下丘脑组织,采用Western blot检测Ghrelin相关蛋白的表达水平。8.腹腔注射CEL 2 h后,4%多聚甲醛心脏灌注,取小鼠脑组织,采用免疫组织化学技术检测下丘脑组织PVN与ARC内的c-Fos的免疫阳性反应神经元的表达,并用Image J软件计算阳性细胞的数量。9.蓖麻油灌胃小鼠造腹泻模型,根据不同的CEL浓度分为四组:(1)模型组:蓖麻油(200μL);(2)低浓度组:CEL 0.5 mg/kg+蓖麻油(200μL);(3)中浓度组:CEL 1 mg/kg+蓖麻油(200μL);(4)高浓度组:CEL 2 mg/kg+蓖麻油(200μL)。统计小鼠首次腹泻的时间以及6 h内每只小鼠腹泻的总次数。10.腹泻模型造模成功后腹腔注射CEL 2 h时取小鼠血清以及空肠组织,采用ELISA检测血清以及空肠组织中VIP、Total ghrelin、GAS的含量。结果1.腹腔注射不同剂量的CEL(0.5、1、2 mg/kg)均对小鼠的胃排空率起显著抑制作用。2.腹腔注射不同剂量的CEL后,CEL(0.5 mg/kg)对小肠推进率略有抑制作用,但无统计学意义;CEL(1、2 mg/kg)对小肠推进率有显著抑制作用。3.腹腔注射不同剂量的CEL后,CEL(0.5、2 mg/kg)的结肠排珠时间显著延长;1 mg/kg组的结肠排珠时间略有延长,但无统计学意义。4.腹腔注射不同剂量的CEL后均能抑制小鼠的排便功能,具体表现为2 h内累计粪便的湿重、干重、以及数目均有显著的减少。5.RT-PCR结果表明,CEL(2 mg/kg)明显降低了胃窦组织Ghrelin和Mboat4的表达水平,对Npy、Cck、Vip、Nos1、Pyy与调控胃肠运动相关基因的表达水平没有影响。CEL对胃底组织以及十二指肠组织中Npy、Nos1、Vip、Cck、Pyy与调控胃肠运动相关基因的表达水平没有影响。CEL对下丘脑组织中Npy、Nos1、Vip、Cck、Nos2、Agrp、Crh、Mch、Orexin、Bdnf与调控胃肠运动相关基因的表达水平没有影响。6.ELISA结果表明,腹腔注射CEL(2 mg/kg)后,小鼠血清中CCK、SS、VIP的浓度显著增加,Active ghrelin、GAS、MBOAT4的浓度显著下降,而血清中的NO、ACH、Total ghrelin的浓度与对照组相比无显著差异;胃窦组织中GAS、Active ghrelin浓度显著下降,VIP浓度显著增加,而胃窦组织中SS的浓度与对照组相比无显著差异;下丘脑组织SS的浓度与对照组相比显著增加,而GAS与Active ghrelin的浓度与对照组相比无显著差异。7.Western blot结果表明,腹腔注射CEL(2 mg/kg)能显著上调PS6和ETV5在胃窦组织中的表达水平。8.免疫组织化学染色结果表明,腹腔注射CEL(2 mg/kg)能显著增加下丘脑组织PVN内的c-Fos的阳性细胞的数量,其余脑区阳性细胞的数量无显著变化。9.CEL能减缓由蓖麻油引起的小鼠腹泻的症状,具体表现为能显著增加由蓖麻油引起的小鼠首次腹泻的时间,但是6 h内腹泻的总次数显著减少。10.腹泻模型中ELISA结果显示,腹腔注射CEL(2 mg/kg)后,小鼠血清中的VIP浓度都显著下降,而血清中的GAS与Total ghrelin的浓度与模型组相比无显著差异;空肠组织中的VIP与Total ghrelin的浓度显著下降,而GAS的浓度与模型组相比无显著差异。结论1.雷公藤红素抑制小鼠胃肠运动的机制主要是通过调控小鼠体内脑肠肽的含量水平实现的,表现为兴奋性的脑肠肽GAS和Active ghrelin含量减少,抑制性脑肠肽SS和VIP含量增加。2.雷公藤红素通过m TORC1-ETV5-MBOAT4通路调控ghrelin的分泌,从而抑制胃肠运动。3.雷公藤红素可以减缓由蓖麻油引起的小鼠腹泻,可能与脑肠肽VIP和Total ghrelin含量下降有关。