作为一个农业大国,我国每年会产生大量的农业废弃生物质。其中纤维素在农业废弃物中的含量高达40%-50%,是农作物通过光合作用实现碳固定的主要产物。高效的纤维素降解技术可实现废弃生物质的可持续利用。与传统的化学处理法相比,利用微生物发酵降解纤维素的生物催化法具有高效且清洁的优点。合理的发酵策略和高效的工程菌株是利用发酵法降解纤维素的关键。其中,以废弃生物质作为固态发酵基质,利用耐高温微生物进行开放式固态发酵,不仅可以显著提高废弃生物质的降解效率,还可以利用高温环境有效抑制开放发酵体系中的杂菌Decitabine体外污染,该过程对加速全球碳循环具有重要的现实意义。然而,尚无纤维素降解模式菌株同时具备较高的纤维素降解综合能力以及高温耐受性。工业微生物育种技术的快速发展,为获得具有优良特性的菌株提供了丰富的策略。其中原生质体融合技术可实现不同种属亲本间优异性能的综合,从而获得同时具备亲本优良性状的进化菌株。本研究利用原生质体融合hepatic vein技术获得了具备较强耐热性能的融合菌株,并以此作为底盘进行基因工程改造,最终获得了可在高温条件下高效降解纤维素的工程菌株。本研究主要包括以下三部分:(1)融合菌株的构建及筛选鉴定。本研究综合评估了可实现纤维素降解的黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、嗜热毁丝霉(MyPuromycin供应商celiophthora thermophila),选取了具有较强生长性能的黑曲霉和具有较强耐热性能的嗜热毁丝霉作为原生质体融合的亲本,并优化了原生质体制备的条件。而后利用聚乙二醇介导的化学融合法进行细胞融合,并对融合过程进行了优化,最终获得了一株在45℃高温环境中具备较优生长性能和较高纤维素酶活性的融合菌株。(2)融合菌株固态发酵过程优化。首先优化了融合菌株的固态发酵过程,确定了最优的固态发酵条件为:玉米秸秆预处理氨水浓度12.95%,发酵初始p H 6.46,液固比2.03,发酵周期5.68天。最后测定了融合菌株纤维素酶活性,滤纸酶活性8.64 U/g,β-葡萄糖苷酶活性18.66 U/g,内切葡聚糖酶活性3.67 U/g,外切葡聚糖酶活性2.45 U/g。(3)高效降解纤维素工程菌株的构建。首先在融合菌株中分别异源表达了编码高效纤维素酶的基因eg7a和cel6a。而后检测了其纤维素酶活性,工程菌株An Mt31-eg7a表达的内切葡聚糖酶活性提高了1.23倍,An Mt31-cel6a表达的外切葡聚糖酶活性提高了1.89倍,并且两种工程菌株表达的纤维素酶都具有较强的耐热性能。本研究通过原生质体融合技术,获得了一株具备较强耐热性能和较优纤维素降解性能的融合菌株,并建立了实现纤维素高效降解的固态发酵策略。而后对融合菌株进行理性改造,异源表达了eg7a和cel6a基因,进一步提高了纤维素酶的综合性能。该研究为提高纤维素酶综合性能提供了一种新颖的策略,并为后续研究提供了指导。